Identificación y estudio de expresión de dos genes relacionados con la abertura y cierre de estomas en Opuntia ficus-indica y Pereskia sacharosa (CACTACEAE)

Abstract

RESUMEN Las cactáceas han evolucionado para crecer en medio ambientes caracterizados por temperaturas elevadas y poca disponibilidad de agua. El mecanismo por el cual han alcanzado dicha adaptación es mediante la regulación de la apertura y cierre de los estomas, que son los poros mediante los cuales se da el intercambio gaseoso entre la planta y la atmósfera, según la demanda del carbono, momento del día y las condiciones de humedad. En cactáceas esta regulación radica en que los estomas abren preferentemente por la noche para evitar la excesiva pérdida de agua y para captar el dióxido de carbono, que en las horas de luz va a ser metabolizado y transformado en compuestos ricos en energía, indispensables para la propia planta y para toda la cadena trófica. La expresión de este tipo de metabolismo llamado Metabolismo Ácido de las Crasuláceas (CAM) requiere de la inducción de varios genes, entre ellos los que actúan directamente sobre el comportamiento del estoma. En este trabajo se estudiaron dos genes relacionados con el movimiento estomático: las -expansinas, que intervienen en los cambios de volumen que experimentan las células guarda al abrir o cerrar el poro, y los péptidos natriuréticos (PNPs) que regulan la homeostasis de agua y solutos. La identificación de estos genes en Opuntia ficus-indica (OfPNPA) y Pereskia sacharosa (PsPNPA) se realizó mediante PCR. El producto de amplificación para -expansina fue de 900 pb. Si bien no se logró la secuenciación de este gen en las especies bajo estudio, el trabajo de laboratorio se realizó con la confianza de que, previamente ya había sido secuenciado dicho gen en guayaba y en otras plantas donde su secuencia fue con una alta similitud a las expansinas, utilizando los mismos oligonucleotidos degenerados. Por otra parte, los productos amplificados de PNPs fueron de aproximadamente 280 pb. Las secuencias obtenidas compartieron el 99% de identidad con un PNP de Hedera helix y con los dominios conservados de expansina y de péptido natriurético. El análisis filogenético mostró que OfPNPA y PsPNPA son homólogos de un PNP de Erucastrum strigosum y de una secuencia EG45 de Arabidopsis thaliana perteneciente al dominio catalítico de las endoglucanasas. Adicionalmente se estimó el 8 número de copias del gen PNP en ambas especies mediante PCR en tiempo real utilizando la actina como gen de referencia. Como resultado, se observó que el gen de PNP se encuentra en una sola copia en los genomas de Opuntia ficus-indica y Pereskia sacharosa. Además se realizó una hibridación in situ para localizar PNPs a nivel de estomas utilizando segmentos de epidermis de Opuntia y como sonda el fragmento OfPNPA y una inmunolocalización con un anticuerpo que reconoce el receptor de péptido natriurético (PN) de humanos (producido en conejo) en epidermis de O. ficus-indica, encontrando una reacción positiva en ambas pruebas. Ya que la expresión génica de expansinas y PNPs podría estar relacionada con los factores que inciden sobre la apertura y cierre estomáticos, se realizó un estudio de la expresión en respuesta a varias concentraciones de ácido indolacético (AIA) que promovería la apertura de los estomas y de ácido abscísico (ABA) que influiría en el cierre estomático en Opuntia ficus-indica y Pereskia sacharosa. Además se determinó el grado de apertura de los estomas en cada concentración. Los resultados mostraron que la mayor respuesta al ABA fue de 100 μM para ambas especies y al AIA de 10 μM para Pereskia y de 100 μM para Opuntia. Para el estudio de expresión se realizaron diversas extracciones de ARN total en ambas especies bajo la inducción de los dos reguladores de crecimiento, donde se obtuvieron resultados parciales ya que la expresión no se observó en varias de las concentraciones evaluadas. A pesar de ello los resultados no fueron concluyentes. Por ejemplo en Pereskia solo amplificó la actina para AIA, no así para PNP y -expansina. En Opuntia el resultado más relevante fue con ABA, en donde se observó una sobreexpresión de PNP y -expansina a 1 mM atribuida a la posible saturación con fitohormona, reflejada en la apertura estomática. Adicionalmente se pretendió relacionar la apertura estomática, el tipo de metabolismo y la expresión de los genes PNP y -expansina, tanto en Citrus aurantifolia (planta C3), como en Opuntia, con una periodicidad de 6 h. Este sondeo mostró un ligero aumento en la expresión de la expansina en limón a las 6 pm donde ocurrió la menor apertura estomática. La resolución en la lectura de las 6 am no fue suficiente, ya que las muestras aparecieron barridas. Esto mismo ocurrió para PNP en todas las lecturas y en las muestras de Opuntia. 9 En el aspecto fisiológico se verificó el metabolismo CAM en base a la determinación de pH cada hora, durante 24 horas, bajo el fundamento de que las plantas CAM presentan una variación de pH a lo largo del día debida a la acumulación nocturna de ácido málico en las vacuolas de las células guarda de los estomas. Para ello se trabajó con cuatro plantas CAM naturales (ex vitro) que fueron Cylindropuntia imbricata (cardenche), Myrtillocactus geometrizans (garambullo), Aloe barbadensis (sábila) y Opuntia sp., además con Opuntia ficus-indica in vitro bajo luz continua y fotoperiodo de 12 h y utilizando Citrus aurantifolia (limón) (planta C3) como control. Los resultados mostraron que en plantas silvestres había un aumento del pH en las horas de mayor incidencia de luz y una disminución de pH desde el atardecer hasta las 9 de la mañana. Este comportamiento no se observó en plantas de Opuntia bajo luz continua, cuyo patrón fue muy parecido al del limón. Sin embargo, al someter estas plantas a un fotoperiodo de 12 h por dos semanas la planta fue recuperando su metabolismo CAM. Además de modificar el metabolismo, las condiciones del cultivo in vitro también afectan la morfología de la planta. A este respecto, se evaluaron las posibles diferencias en la tipología, frecuencia y densidad estomáticas en tres zonas de la planta: apical, media y basal bajo dos condiciones de cultivo (in vitro y ex vitro) en cuatro especies de cactáceas: O. ficus-indica, Hylocereus undatus, Escontria chiotilla y Mammillaria petterssonii. Se obtuvo la densidad estomática (DE) y el índice estomático (IE) en cada uno de los niveles de ambos factores (zona y tipo de cultivo). Los resultados mostraron que los estomas corresponden al tipo ciclocítico, tetracítico u opuntioide en O. ficus-indica y de tipo paralelocítico en E. chiotilla, H. undatus y M. pettersoni. Se observó que en el cultivo ex vitro la DE fue menor que en condiciones in vitro, exceptuando H. undatus. La región apical fue la que presentó mayor DE tanto in vitro como ex vitro y la interacción entre el tipo cultivo y las zonas del explante fueron altamente significativas, lo cual implica que el impacto del tipo de cultivo es diferente en las zonas del tallo.

ABSTRACT Cacti have evolved to grow in environments characterized by high temperatures and low water availability. The mechanism for this adaptation is by regulate the opening and closing of stomata, which are pores through which gas exchange occurs between the plant and the atmosphere, as carbon demand, time of day and moisture conditions are required. In cacti, this regulation is by stomatal opening at night to prevent excessive water loss and to capture carbon dioxide, which in daylight hours will be metabolized and converted into energy-rich compounds, essential for the own plant and for the whole food chain. Expression of this type, called CAM metabolism, requires induction of several genes, including those that act directly on the behavior of the stoma. In this work we study two genes related with stomatal movement: The α-expansins, involved in volume changes experienced by guard cells when opening or closing the pores, and natriuretic peptides (PNPs) that regulate water homeostasis and solutes. The identification of these genes in Opuntia ficus-indica (OfPNPA) and Pereskia sacharosa (PsPNPA) was performed by PCR. The amplification product for α-expansin was 900 bp. While the sequencing of this gene was not achieved in the species under study, the laboratory work was performed with the confidence that we had been previously sequenced this gene in guava using the same degenerated oligonucleotides. Moreover, the amplification products of PNPs were approximately 280 bp. The obtained sequences shared 99% identity with Hedera helix PNP and with conserved expansin and natriuretic peptide domains. Phylogenetic analysis showed that PsPNPA and OfPNPA are homologous to a Erucastrum strigosum PNP and an EG45 sequence from Arabidopsis thaliana belonging to the endoglucanases catalytic domain. Additionally, the copy number of PNP gene in both species was estimated by real-time PCR using actin as reference gene. We found that the PNP gene has a single copy in O. ficus-indica and P. sacharosa genomes. Moreover hybridization in situ was performed to localize PNPs at stomata level, using Opuntia epidermis segments and OfPNPA fragment as a probe. The immunolocalization was performed with a specific antibody recognizing the human natriuretic peptide receptor (PN) (produced in rabbits) in cactus epidermis. We found a positive reaction in both tests. 11 Since gene expression of expansins and PNPs could be related to stomatal opening and closing factors, an expression study was done in response to several concentrations of indole acetic acid (IAA) and abscisic acid (ABA) in O. ficus-indica and P. sacharosa. Furthermore, the opening grade of the stomata in each concentration was determined. The results showed that the highest response to ABA was 100 uM for both species and 10 uM for Pereskia and100 uM for Opuntia for AIA. In order to study the gene expression, different RNA extractions in both species under both inducing growth regulators were performed. However the results were inconclusive. For example, in Pereskia actin amplified only for AIA, but not for PNP and α-expansin. In Opuntia the most relevant result was with ABA, wherein an overexpression of PNP and α-expansin at 1 mM attributed to the possible saturation with this phytohormone, was reflected in stomatal opening. Additionally we try to relate stomatal opening, type of metabolism and expression of the PNP and α-expansin genes, in Citrus aurantifolia (C3 plant), and Opuntia, with a periodicity of 6 h. This analysis showed a slight increase in expansin expression at 6 pm in lemon where the lower stomatal opening occurred. Resolution reading at 6am was not enough, because the samples appeared swept. The same happened to PNP in all readings and Opuntia samples. In physiological aspects, CAM metabolism was verified based on pH determination every hour for 24 hours, on the basis that the CAM plants show a pH variation throughout the day due to accumulation of malic acid in the guard cells vacuoles of stomata. For this experiment we worked with four natural CAM plants (ex vitro): Cylindropuntia imbricata (cardenche), Myrtillocactus geometrizans (garambullo), Aloe barbadensis (sábila) and Opuntia sp., we also include O. ficus-indica in vitro under continuous light and 12 h photoperiod using C. aurantifolia (limón) (C3 plant) as a control. The results showed that the wild plants had a pH increase in the hours of greatest incidence of light and a decrease in pH from sunset until 9 am. This behavior was not observed in Opuntia plants under continuous light whose pattern was very similar to the lemon. However when these plants were subjecting to a 12 h photoperiod for two weeks, the plants recovering their CAM metabolism. 12 In addition to changes in the metabolism, in vitro culture conditions also affect the plant morphology. In this respect, the differences in the type, frequency and stomatal density in three plant areas, apical, middle and basal, were evaluated under two different culture (in vitro and ex vitro) in four species of cacti: O. ficus-indica, Hylocereus undatus, Escontria chiotilla and Mammillaria petterssonii. Stomatal density (SD) and stomatal index (SI) in each condition was obtained. The results showed that stomata are of the ciclocitic, tetracytic or opuntioide type in O. ficus-indica and paralelocitic type in E. chiotilla, H. undatus and M. petterssonii. It was observed that in ex vitro culture, SD was lower than in in vitro conditions, except in H. undatus. The apical region has more SD in both in vitro and ex vitro conditions and the interaction between culture types and areas of the explant was highly significant, which implies that the impact on the culture is different depending of the stem area.