RESUMEN
La marchitez del chile causada por Phytophthora capsici es un grave problema en México como en el resto del mundo debido a las pérdidas económicas y al uso inadecuado e indiscriminado de los fungicidas que han generado resistencia en el patógeno, contaminación ambiental y toxicidad. Ello ha motivado la búsqueda de métodos alternativos, efectivos y no perjudiciales para su manejo. El control biológico mediante organismos antagónicos representa una valiosa herramienta no química para la protección de los cultivos, lo que ha provocado que se intensifiquen los esfuerzos por detectar microorganismos con potencial como agentes de control. Por ello, en éste trabajo de tesis se evaluó la capacidad de Trichoderma koningiopsis y Trichoderma harzianum como agentes de control biológico de Phytophthora capsici en plantas de chile (Capsicum annuum L.), así como las interacciones en el patosistema, siguiendo los siguientes objetivos: 1. Seleccionar dos especies del género Trichoderma con base a su antagonismo in vitro; 2. Evaluar la efectividad individual y combinada de las cepas seleccionadas; 3. Comparar la efectividad de diferentes métodos de inoculación de los antagonistas contra P. capsici en plantas de chile y 4. Analizar las interacciones entre antagonista, patógeno y hospedero con el uso de microscopia electrónica de barrido (MEB). El documento se divide en tres capítulos; en el primero se abordan las pruebas in vitro para la selección de dos especies de Trichoderma, para lo cual primero se aislaron e identificaron dos cepas de P. capsici a partir de plantas de chile ancho con marchitez en campo. Se hicieron pruebas con repeticiones de cultivos duales para evaluar el antagonismo de T. harzianum (Th-7), T. koningiopsis (HTE 808) y T. asperellum (NRRL 50191) contra P. capsici considerando el crecimiento de los antagonistas y del patógeno como controles. Se registró el crecimiento de ambas colonias cada 12 h hasta el contacto entre las mismas. También se realizaron conteos de esporangios de P. capsici en la zona de contacto entre micelios. Los tres antagonistas detuvieron el crecimiento del patógeno al entrar en contacto, pero solo en T. asperellum y T. koningiopsis se observó hiperparasitismo. T. harzianum mostró la mayor velocidad de crecimiento individual y confrontado con P. capsici, en tanto que T. koningiopsis mostró el mayor efecto inhibitorio en la esporulación del patógeno. Con base en lo anterior, T. harzianum y T. koningiopsis fueron las dos cepas seleccionadas para las pruebas de antagonismo en planta. Los objetivos del capítulo 2 consistieron en evaluar la efectividad de dos especies de Trichoderma como controladores biológicos de P. capsici en plantas de chile y comparar tres métodos de inoculación de los antagonistas (en semilla, en planta y en semilla+planta). Los dos antagonistas fueron aplicados de manera individual y combinada en semilla (antes de la siembra) y en planta de chile tipo Húngaro (susceptible a P. capsici). Las plantas de chile fueron posteriormente inoculadas con 5 ml de una suspensión ajustada a 2000 zoosporas ml-1 de P. capsici (cepa RES). Como variables de respuesta asociadas a la protección por Trichoderma spp. se registró el tamaño de la lesión necrótica basal (mm) por planta y la severidad de marchitez por planta usando una escala de 0 (planta sana, sin marchitez) a 4 (planta muerta por marchitez). Para evaluar el efecto de Trichoderma spp. sobre el vigor de la planta se registró la altura y grosor del tallo basal por planta antes de la inoculación con P. capsici. Los resultados del capítulo 2 mostraron que T. koningiopsis es la que más disminuye la marchitez por P. capsici cuando es inoculad en semilla, mientras que T. harzianum fue más eficiente cuando se inoculó en semilla y en planta. El tratamiento con los dos antagonistas mezclados no resulto eficiente. Tampoco se observó mejora en el vigor de las plantas tratadas con las dos especies de Trichoderma solas o combinadas. Finalmente, en el tercer capítulo el objetivo consistió en documentar las interacciones entre antagonista-patógeno y hospedero utilizando microscopia electrónica de barrido. Se obtuvieron microfotografías que muestran la interacción entre Trichoderma y P. capsici, y entre P. capsici y raíces de C. annuum. Se utilizaron plántulas de chile que fueron inoculadas con los antagonistas y P. capsici por separado. Se incubaron y se fijó el tejido en AFA a las 0, 2, 4 y 8 h de incubación. Parte de las plántulas fueron inoculadas con Trichoderma por inmersión en una solución de zoosporas y después incubadas para ser fijadas a las 2, 4 y 8 h de incubación. Las muestras fueron procesadas y observadas en el MEB. Se observó una atrofia celular en las plantas por la presencia de Trichoderma y P. capsici. Es probable que P. capsici utilice las lenticelas como acceso a la planta y que Trichoderma utilice un arsenal enzimático para penetrar el tejido. El proceso de infección en la planta ocurre dentro de los 30 minutos después de la inoculación. Los resultados de la tesis permitieron derivar las siguientes conclusiones generales: Las cepas de T. koningiopsis (HTE 808) y T. harzianum (Th-7), tienen características deseables para ser empleados como controladores biológicos de P. capsici. Sin embargo, deberán ser parte de un manejo integrado, ya que no confieren una protección del 100% contra el patógeno. Además, una mejor comprensión del funcionamiento de los mecanismos involucrados en el patosistema podría estimular el desarrollo de nuevas biotecnologías que nos acerquen al manejo de enfermedades y por ende a la mejora en la producción de diversos cultivos, sin que con ello se cause un daño al ecosistema.
ABSTRACT
Chili pepper wilt caused by Phytophthora capsici is a serious problem in Mexico, as well as in the rest of the world, due to the economic losses and the inadequate and indiscriminate use of fungicides that have generated resistance in the pathogen, environmental contamination, and toxicity. That has motivated the search for alternative methods that are effective and not harmful for it’s managed. The biological control by means of antagonistic organisms represents a valuable non-chemical tool for the protection of the crops, which has provoked intensification in the efforts to detect microorganisms with potential as control agents. This is why the capacity of Trichoderma koningiopsis and Trichoderma harzianum as agents of biological control of Phytophthora capsici in chili plants (Capsicum annuum L.), and the interactions in the pathosystem, were evaluated in this thesis, following these objectives: 1. Selection of the two strains of the genus Trichoderma based on their in vitro antagonism 2. Evaluate the effectivity of the selected strains, both individually as well as combined. 3. Compare the effectivity of different inoculation methods of the antagonists against P. capsici in chili plants, and 4. Analyze the interactions among the antagonist, pathogen and the host, with the use of the electronic microscope. In this manner, the document is divided into 3 chapters. In the first one, the in vitro studies for the selection of the two Trichoderma spp. strains are approached, for which two strains of P. capsici were isolated and identified from “chile ancho” plants with wilt in the field. Trials were made with repetitions of dual culture to evaluate the antagonism among P. capsici with strains of T. harzianum (Th-7), T. koningiopsis (HTE 808) and T. asperellum (NRRL 50191), and the individual growth of the antagonists and the pathogen as controls was considered. The growth of the colonies was registered every 12 hours until contact among them. Counts of P. capsici sporangium in the contact zone between mycelia were also performed. The three antagonists stopped the growth of the pathogen upon contact, but only in T. asperellum and T. koningiopsis was hyperparasitism observed. T. harzianum showed the most growth, alone and in confrontation with P. capsici and T. koningiopsis had the biggest inhibitory effect in the sporulation of the pathogen. For all the above reasons, T. harzianum and T. koningiopsis were the two selected strains for the essays of antagonism in plants. The objectives of the chapter 2 consisted on evaluating the effectivity of the two strains of Trichoderma as biological controllers of P. capsici in chili plants and comparing three methods of inoculation of the antagonists ( in seed, in plant and in seed + plant). The two antagonists were applied individually and combined in seed (before sowing) and in plants of Hungarian-type chili (susceptible to P. capsici). The chili plants were later inoculated with 5 ml of a zoospore suspension adjusted to 2000 P. capsici zoospores per ml (RES strain). As the variables associated to Trichoderma spp., the size of the necrotic lesions (mm) and the severity of witlting per plant were registered using a scale from 0 (healthy plan, without wilt) to 4 (dead plant for wilt). To evaluate the effect of Trichoderma spp. in the vigor of the plant, the height and width were registered before being inoculated with P. capsici. The results of chapter 2 showed that T. koningiopsis is the one that most decreases wilt caused by P. capsici when it is inoculated in seed, while T. harzianum was the most effective when it was inoculated in seed and in plant. The treatments that included the two antagonists did not show efficiency. Neither an improvement on the vigor of the plants treated with the species of Trichoderma (alone or in combination) was shown. Lastly, in the third chapter the objective consisted in documenting the interactions among antagonist-pathogen and host using electronic microscopy. Photomicrographs were obtained that show the interaction between Trichoderma and P. capsici and between P. capsici and C. annuum roots. Chili seedlings inoculated separately with antagonists and P. capsici were used. They were incubated and the tissue in AFA was set at 0, 2, 4, and 8 hours of inoculation. Part of the seedlings was inoculated with Trichoderma, treated by immersion in a zoospore solution, and afterwards incubated to be set at 2, 4, and 8 hours of incubation. The samples were processed and observed in the electronic microscope. A cellular atrophy was observed in the plants by the presence of Trichoderma and P. capsici. It is probable that P. capsici uses the lenticels as access to the plant and that Trichoderma uses an enzymatic arsenal to penetrate the tissue. The infection process occurs during the first 30 min after the inoculation. The results of the thesis allowed the derivation of the following general conclusions: The strains of T. koningiopsis (HTE 808) and T. harzianum (Th-7), have desirable characteristics to be used as biological controls of P. capsici; nevertheless, they must be part of an integrated management, because they don’t confer 100 % protection. Also, a better comprehension of the operation of the mechanisms involved in the pathosystem could stimulate the development of new biotechnologies that take us closer to disease control, and therefore, to the improvement in the production of different crops, without this causing harm in the ecosystem.
