Patógenos asociados a biopelículas en agua de consumo en granjas porcícolas en el Estado de Aguascalientes

Abstract

Respiratory diseases in pigs are one of the most important health problems in these animals. Due to the multifactorial nature of these diseases are considered as a porcine respiratory disease complex (PRDC). The PRDC is the term used to describe pneumonic diseases caused by multiple infectious agents that cause weight loss in animals or death. In the PRDC multiple pathogens (bacteria and/or viruses) work in combination to induce this respiratory disease. Within this complex, the bacteria Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus parasuis and Mycoplasma hyopneumoniae are the main bacterial pathogens involved in causing great economic losses to the swine industry. In this research project, one objective was to estimate the presence of A. pleuropneumoniae, S. suis, P. multocida, B. bronchiseptica, H. parasuis and M. hyopneumoniae in the upper respiratory tract of asymptomatic pigs in representative swine farms in Aguascalientes state in Mexico using PCR technique. The study was performed in 14 swine farms. We obtained a total of 162 nasal swabs. Twenty point thirty-seven percent of samples were positive for A. pleuropneumoniae (located in the 78.57% of farms), 18.52% were positive for S. suis (in 85.71% of farms), of these, corresponding to 3.09% S. suis serotype 2, 30.86% were positive for H. parasuis (92.86% of farms), 28.4% of the samples to P. multocida (in 78.57% of farms), and 22.84% to M. hyopneumoniae (in 64.29% of farms). We did not detect the presence of B. bronchiseptica in this study. With the first part of this study we observed that bacterial pathogens of PRDC were present in the upper respiratory tract of pigs in all farms studied; therefore, these pathogens are widely disseminated in pig farms of Aguascalientes, Mexico. In the other hand, A. pleuropneumoniae is the etiologic agent of porcine contagious pleuropneumonia that causes great economic losses in the pig industry. Fifteen serotypes of A. pleuropneumoniae have been described based on capsular antigens and two biotypes described based on nicotinamide adenosine dinocleotide (NAD) requeriments. All serotype are obligate pathogens, but differ in virulence and regional distribution. In Mexico serotypes of biotypes 2 has yet to be reported. A. pleuropneumoniae has traditionally been considered an obligate pathogen of pigs. However the presence of A. pleuropneumoniae in the environment has yet to be thoroughly investigated. Here was detected A. pleuropneumoniae, found in biofilms isolated from drinking water and directly in the drinkers of swine farms. Samples of drinking water were taken directly from the watering places in the swine farm, aseptically to avoid contamination. A. pleuropneumoniae detection was performed by PCR analysis using primers again apxIV toxin gene. Detection of A. pleuropneumoniae in drinking water was achieved in 5 farms; and from 3 of them were able to obtain 20 positives samples for A. pleuropneumoniae. In all samples, A. pleuropneumoniae growth independent of NAD in BHI media. Also, in these samples were detected for 16S rDNA Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter schindleri and Escherichia coli. All samples had the ability to form biofilms in the liquid-air interface in vitro and A. pleuropneumoniae biofilm formation was observed in vivo by FISH assay. The samples were subjected to antimicrobial susceptibility testing. In conclusion, our data suggest that A. pleuropneumoniae has the ability to survive in aquatic environments using biofilms to survive outside its host, and could be surviving in association with other bacteria in a multi-species biofilm. Likewise, A. pleuropneumoniae has the ability to form biofilms in vitro. Several respiratory tract infections are associated with biofilm formation, and A. pleuropneumoniae has the ability to form biofilms in vitro. Biofilms are structured communities of bacterial cells enclosed in a self-produced polymer matrix that are attached to an abiotic or biotic surface. The ability to form biofilms is now considered a universal trait of microorganisms, and multispecies biofilms are the most common form of microbial growth in nature. The goal of this part of the study was to determine the ability of A. pleuropneumoniae to form multi-species biofilms with other swine bacterial pathogens in the absence of pyridine compounds (nicotinamide mononucleotide [NMN], nicotinamide riboside [NR] or nicotinamide adenine dinucleotide [NAD]) that are essential for the growth of A. pleuropneumoniae. For the biofilm assay, strain 719, a field isolate of A. pleuropneumoniae serotype 1, was mixed with swine isolates of Streptococcus suis, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Staphylococcus aureus or Escherichia coli, and deposited in 96-well microtiter plates. Based on the crystal violet and CFU results, A. pleuropneumoniae was able to grow with every species tested in the absence of pyridine compounds. Interestingly, A. pleuropneumoniae was also able to form strong biofilms, according with their thickness, when mixed with S. suis, B. bronchiseptica, P. multocida or S. aureus. In the presence of E. coli, A. pleuropneumoniae only formed a weak biofilm. The live and dead populations, and the matrix composition of multi-species biofilms were also characterized using fluorescent markers and enzyme treatments. The results indicated that poly-N-acetylglucosamine remains the primary component responsible for the biofilm structure. In conclusion, A. pleuropneumoniae is able to acquire pyridine compounds from other swine pathogens, which enables A. pleuropneumoniae to grow and form multi-species biofilms. In conclusion, our data suggest that A. pleuropneumoniae has the ability to survive in aquatic environments and use multi-species biofilms as mean to survive outside its host. Finally, if this capacity for form multi-species biofilms is involved in the persistence and virulence in its host, should be investigated in more detail.

Las enfermedades respiratorias en cerdos son uno de los más importantes problemas de salud en este animal. Debido a la naturaleza multifactorial de estas enfermedades son conocidas como parte del complejo respiratorio porcino (CRP). El CRP es el término usado para describir enfermedades de tipo pneumónicas causadas por múltiples agentes infecciosos que causan desde pérdida de peso a los animals hasta la muerte. En el CRP, múltiples patógenos (bacterias y/o virus) trabajan en combinación para inducir estas enfermedades respiratorias. Dentro de este complejo, las bacterias Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus parasuis y Mycoplasma hyopneumoniae, son las principals bacterias patógenas involucradas en causar grandes pérdidas económicas a la industria porcícola. En este trabajo de investigación, uno de los primeros objetivos fue estimar la presencia de A. pleuropneumoniae, S. suis, P. multocida, B. bronchiseptica, H. parasuis y M. hyopneumoniae en el tracto respiratorio superior de cerdos asintomáticos en granjas porcícolas del Estado de Aguascalientes, México, usando la técnica de PCR. El estudio fué realizado en 14 granjas porcícolas. Se obtuvieron un total de 162 muestras de exudado nasal. Veinte punto treinta y siete porciento de las muestras fueron positvas para A. pleuropneumoniae (localizadas en el 78.57% de las granjas), el 18.52% fueron positivas a S. suis (en el 85.71% de las granjas), de las cuales, el 3.09% del total corresponden a S. suis serotipo 2; el 30.86% fueron positivas a H. parasuis (en el 92.86% de las granjas), el 28.2% de las muestras a P. multocida (en el 78.57% de las granjas), y el 22.84% a M. hyopneumoniae (en el 64.29% de las granjas). No se logró la detección de B. bronchiseptica en este estudio. Con esta primera parte, se puede observer que las bacterias patógenas del CRP están presentes en el tracto respiratorio superior de los cerdos en todas las granjas estudiadas; así mismo, que estos patógenos están ampliamente diseminados en las granjas porcícolas en el Estado de Aguascalientes. A. pleuropneumoniae es el agente etiológico de la pleropneumoniae porcina contagiosa, la cual, causa grandes pérdidas económicas en la industria porcícola. Quince serotipos de A. pleuropneumoniae han sido descritos basados en sus antigenos capsulares y dos biotipos en base a la dependencia de nicotinamida adenosina dinucleotido (NAD). Todos los serotipos son patógenos obligados, pero difieren en su virulencia y en su distribución. En México, serotipos pertenecientes al biotipo 2 no han sido reportados. A. pleuropneumoniae ha sido tradicionalmente considerado un patógeno obligado de cerdos. Sin embargo, su presencia en el ambiente no ha sido fuertemente investigada. Aquí, nosotros detectamos a A. pleuropneumoniae en biopelículas aisladas de agua de consume y directamente de bebederos de granjas porcícolas. Muestras de agua de consumo fueron tomadas directamente de los bebederos en las granjas de manera aséptica para evitar contaminación. La detección de A. pleuropneumoniae fue realizada por PCR mediante el uso de oligos contra el gen de la toxina ApxIV. La detección de este patógeno en agua de consume fue llevada a cabo en 5 granjas; dondede tres de estas granjas fueron obtenidas 20 muestras positivas para A. pleuropneumoniae. En todas las muestras, A. pleuropneumoniae creció de manera independiente de NAD en medio BHI. Además, en estas muestras fueron detectadas por ADNr 16S las bacterias Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter schindleri y Escherichia coli. Todas las muestras tuvieron la habilidad de formar biopelículas in vitro en la interface líquiod-aire y la formación de biopelículas por parte de A. pleuropneumoniae fue también observada in vivo mediante hibridación fluorescente in situ. Las muestras fueron sometidas a ensayos de susceptibilidad antimicrobial. Con lo anterior, nuestros datos sugieren que A. pleuropneumoniae tiene la habilidad de sobrevivir en ambientes acuáticos usando biopelículas para su supervivencia fuera de su huésped, y que podría estar sobreviviendo gracias a asociaciones con otras bacterias formando biopelículas multi-especies. A. pleuropneumoniae tiene la habilidad de formar biopelículas in vitro. Así mismo, se conoce que varias enfermedades respiratorias infecciosas son asociadas con la formación de biopelículas. Las biopelículas son comunidades de bacterias encerradas en una matriz de polímeros que ellas mismas producen y que están adheridas a una superficie viva o inerte. La habilidad de formar biopelículas es ahora considerada un atributo universal de todos los microorganismos y la formación de biopelículas de multiples especies es la manera más común en que los microorganismos crecen en la naturaleza. Por lo anterior, el objetivo de esta parte de la investigación fue determinar la capacidad que el patógeno respiratorio porcino, A. pleuropneumoniae, tiene para formar biopelículas multi-especies con otros patógenos de cerdo en la ausencia de compuestos de piridina (nicotinamida mononucleotido [NMN], nicotinamida ribosida [NR] o nicotinamida adenina dinucleotido [NAD]) que son escenciales para el crecimiento de A. pleuropneumoniae. Para esta parte del estudio, fué utilizado un aislado de cerdo de A. pleuropneumoniae perteneciente al serotipo 1, cepa 719. A. pleuropneumoniae fue mezclado con los aislados de cerdo Streptococcus suis, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Staphylococcus aureus o Escherichia coli, y depositados en microplacas de 96 posillos. Basados en los resultados de los ensayos decristal violeta y de las UFC, A. pleuropneumoniae fue capaz de crecer con todas las especies usadas en ausencia de compuestos de piridina. Interesantemente, A. pleuropneumoniae fué capaz de formar una gruesa biopelícula en presencia de S. suis, B. bronchiseptica, P. multocida o S. aureus. En presencia de E. coli, A. pleuropneumoniae unicamente formó una biopelícula débil. Así mismo, fueron analizados los cambios que ocurrieron en la composición de la matriz extracelular y en el número de bacterias vivas o muertas en las biopelículas multi-especies con la ayuda de marcaje fluorsecente y tratamientos enzimáticos. Los resultados indican que la poli-N-acetilglucosamina permanence como el principal componente responsable de la estructura de la matriz. En conclusión, A. pleuropneumoniae fué capaz de adquirir compuestos de piridina de otros patógenos porcinos, lo que le permite a A. pleuropneumoniae crecer y formar biopelículas multi-especies. En conclusión, todos nuestros datos sugieren que A. pleuropneumoniae tiene la habilidad de sobrevivir en ambientes acuáticos y que podría utilizar biopelíulas multi-especies como su principal forma de sobrevivir fuera de su huésped. Finalmente, si esta capacidad para formar biopelículas multi-especies esta involucrada en su persistencia y virulencia en su huésped, debe ser investigada con mayor detalle.