Generación y cultivo de raíces transformadas en cactáceas sudamericanas

Abstract

Se desarrollaron sistemas para la propagación in vitro a través de la activación areolas (yemas axilares) para Echinopsis ancistrophora, Echinopsis mirabilis, Echinopsis huotii subsp vallegrandensis, Eriosyce aurata, Eulychnia breviflora y Gymnocalycium chubutense. Como fuente de explantes se usaron plántulas germinadas in vitro. Se logró la formación de brotes múltiples a partir de las yemas en medio basal MS con 3% de sacarosa, 10 g L-1 agar y suplementado con 0.5 mg L-1 y 1.0 mg L-1 de 6-bencilaminopurina (BA). Las eficiencias más altas de producción de brotes fluctuaron entre 4.9 en Eulychnia breviflora hasta 14.4 brotes por explante en Echinopsis huotii subsp vallegrandensis en medio basal MS suplementado con 1.0 mg L-1 de BA. Además se evaluó la susceptibilidad a A. rhizogenes en Echinopsis ancistrophora, Echinopsis mirabilis, Echinopsis huotii subsp vallegrandensis, Eriosyce aurata, Eulychnia breviflora, Gymnocalycium chubutense, Frailea castanea (Frailea asteroides) y Matucana madisoniorum. Los explantes fueron tomados de plantas cultivadas in vitro y fueron inoculados con Agrobacterium rhizogenes A4 cepa de tipo agropina que contiene el plásmido silvester RiA4 y el vector binario pESC4 con los genes nptII y gus. Raíces presuntamente transformadas se produjeron directamente de heridas o a partir de tejido calloso generado en cuatro de las especies evaluadas, Echinopsis ancistrophora, E.mirabilis, E. huotii subsp vallegrandensis, y Gymnocalycium chubutense. La frecuencia de la formación de raíces pilosas, el número de raíces por explante y sus tasas de crecimiento fueron variables entre las especies analizadas. En las cuatro especies restantes, la producción de raíces transformadas no se observó bajo las condiciones utilizadas en estos experimentos. La detección histoquímica de la actividad de la β - glucuronidasa (GUS ) demostró la expresión de este gen extraño en las raíces peludas. Los análisis de PCR demostraron la presencia de los genes rolB y nptII en el ADN de las raíces transformadas.

In vitro propagation systems by means of areole activation were developed for Echinopsis ancistrophora, E. mirabilis, Echinopsis huotii subsp vallegrandensis, Eriosyce aurata, Eulychnia breviflora and Gymnocalycium chubutense. In vitro germinated seedlings were used as source of explants. Multiple shoot formation from areoles was achieved on MS basal with 3% sucrose, 10 g L-1 agar and medium supplemented with 0.5 mg L-1 and 1.0 mg L-1 of 6-benzylaminopurine (BA). Efficiencies ranged from 4.9 shoots per explant in Eulychnia breviflora to 14.4 shoots per explant in Echinopsis huotii subsp vallegrandensis in MS basal medium supplemented with 1.0 mg L-1 of 6-benzylaminopurine (BA). Also susceptibility to Agrobacterium rhizogenes was evaluated in Echinopsis ancistrophora, E. mirabilis, E. huotii subsp vallegrandensis, Eriosyce aurata, Eulychnia breviflora, Gymnocalycium chubutense, Frailea castanea (Frailea asterioides) y Matucana madisoniorum. Stem discs taken from in vitro cultured plants were inoculated with Agrobacterium rhizogenes A4 agropine-type strain that contains the wild RiA4 plasmid and the binary vector pESC4 with the nptII and gus genes. Hairy roots were produced directly from wounds, or starting from calli generated on the wounded surface, in four of the evaluated species, Echinopsis ancistrophora, E.mirabilis, E. huotii subsp vallegrandensis, y Gymnocalycium chubutense. The frequency of hairy roots formation, the number of roots per explant and its growth rates were variable among the tested species. In the four remaining species the production of transformed roots was not observed under the conditions used in these experiments. Histochemical detection of β-glucuronidase (GUS) activity demonstrated the expression of this foreign gene in the hairy roots. PCR analyses demonstrated the presence of the rolB and nptII genes in the DNA of the transformed roots.