Desarrollo in vitro y capacidad biosintética de raíces de Cactáceas transformadas con los genes silvestres de A. rhizogenes

Abstract

RESUMEN Se transformaron explantes axénicos de veinticinco especies de la familia Cactaceae con la cepa de tipo agropina de Agrobacterium rhizogenes A4 con el plásmido ESC4 que contienen los genes nptII y gus para establecer cultivos de raíces transformadas. Se evaluó la eficiencia de trasformación de dichas especies en diferentes concentraciones del medio basal de cultivo MS (100, 75, 50 y 25%), las cuales mostraron una gran variación incluso entre miembros del mismo género. La mayoría de las especies alcanza su pico de crecimiento máximo a los 30 o 45 días de cultivo, llegando a una fase estacionaria. La fase estacionaria de la mayoría de las especies tuvo una duración de varios meses, por lo que los cultivos de raíces transformadas se lograron establecer hasta después de cuatro a seis meses en la mayoría de las especies. Los cultivos establecidos de raíces transformadas de Turbinicarpus lophophoroides se cultivaron bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 de obscuridad donde mostraron un mayor incremento de biomasa comparado con su cultivo en obscuridad permanente. Se probó la espuma de poliuretano como soporte alternativo en el cultivo de raíces transformadas, el cual resultó en crecimiento semejante al obtenido en raíces cultivadas en agar. Se evaluó la producción de biomasa de seis especies de cactáceas (Escobaria chaffeyi, Ferocactus peninsulae Mammillaria bocasana var. bocasana, Turbinicarpus lophophoroides, T. schmiedickeanus var. shwarzii y T. pseudopectinatus) en doce medios basales de cultivo diferentes. Se encontró que es necesario optimizar el tipo y concentración del medio de cultivo basal para cada especie estudiada, como se llevó a cabo en este estudio. La composición de los diferentes medios de cultivo afectó la morfología de las raíces transformadas, lo que también puede sugerir diferencias en la producción de metabolitos secundarios en estas líneas de raíces pilosas. Con a finalidad de disminuir costos de labor y de consumible se evaluó la producción de biomasa entre las de raíces transformadas cultivadas en medio de cultivo semisólido y en el sistema de inmersión temporal RITA®. No hubo diferencia significativa entre los dos tratamientos, sin embargo, las raíces

presentaban morfología homogénea y no generaron tejido calloso. Se generaron brotes a partir de los cultivos de raíces transformadas de manera espontánea. Se logró multiplicar estos brotes y aclimatarlos a condiciones de invernadero. Esto con la única finalidad de realizar estudios posteriores con este material vegetal. Mediante el análisis histoquímico para la actividad de GUS se confirmó la transformación exitosa de las raíces presuntamente transformadas mediante A. rhizogenes, observándose una coloración azul intensa en todos los tejidos presuntamente transformados de los cultivos ya establecidos de raíces transformadas. Se observaron diferencias en la actividad de GUS al comparar raíces transformadas y brotes (normales y vitrificados) de E. chaffeyii, Turbinicarpus laui y T. pseudopectinatus generados a partir de éstas mediante un ensayo fluorométrico. Se observó gran variación de la actividad de la enzima GUS entre las tres especies estudiadas, siendo E. chaffeyii la de mayor actividad. Las raíces transformadas mostraron mayor actividad de GUS que los brotes. Con la técnica PCR se confirmó la transferencia del T-DNA de A. rhizogenes al genoma de la planta amplificando los genes rolB, nptII y gus. También se aseguró que no se tratara del ADN de la bacteria analizando la presencia del gen vir que se encuentra fuera del T-DNA, por lo que no debe estar presente en tejidos vegetales transformados libres de A. rhizogenes. Se detectaron betacianinas, betaxantinas y ácido betalámico en algunas especies de cactáceas. Se encontraron concentraciones significativas de ácido betalámico, precursor de estos pigmentos, en la mayoría de las especies. El contenido de betaxantinas es bajo en la mayoría de las especies, excepto en Escobaria chaffeyii donde fue aproximadamente 0.05 mg/g de peso fresco. El contenido de betacianinas fue mayor en Turbinicarpus lophophoroides, E. chafeyii y T. laui, lo que coincide con el contenido de ácido betalámico en estas especies. Se analizó el efecto del medio de cultivo sobre la producción de betalaínas en raíces transformadas de T. laui. La concentración de betacianinas fue mayor cuando se cultivaron en medio DKW y menor en medio WPM. Los diferentes medios de cultivo no modificaron la producción de betaxantinas en T. laui. Mediante la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas se logró identificar al compuesto de tipo

alcaloide más común en muchas especies de cactáceas, la hordenina, en la mayoría de las especies estudiadas. También se identificaron algunas betafenetilaminas, ambos compuestos son de interés farmacológico. El extracto total de raíces transformadas de T. lophophoroides no se presentó actividad bactericida ante la bacteria patógena E. coli. Este estudio contribuye a la conservación y explotación racional de varias especies de cactáceas mexicanas al proveer un método para obtener compuestos útiles de una manera sustentable, o sea utilizando raíces transformadas en lugar de colectar ejemplares en su hábitat silvestre. Además, abre varias posibles líneas de investigación sobre el tema, siendo algunas de las más interesantes el escalamiento de los cultivos de raíces transformadas a biorreactores y la posibilidad de generar plantas transgénicas completas.

ABSTRACT Axenically grown explants of twenty-five species of the family Cactaceae were inoculated with an Agrobacterium rhizogenes A4 agropinetype strain carrying the ESC4 plasmid, which contains the nptII and gus genes. The transformation efficiency of all species when cultured on different MS basal media concentrations (100, 75, 50 and 25%) showed great variation, even between members of the same genus. Most species reach their maximum growth at thirty to forty days of culture, reaching a stationary phase. The latter lasted for several months for most species, thus, hairy root cultures were established until after four to six months. Established hairy roots cultures of Turbinicarpus lophophoroides were cultured under a photoperiod of 16 hours of light and 8 hours of darkness, best growth was achieved under light:dark conditions. Polyurethane foam was tested as an alternative for hairy root culture, which resulted in similar growth to the one obtained in roots grown in agar. Biomass production was assessed for six cacti species (Escobaria chaffeyi, Ferocactus peninsulae Mammillaria bocasana var. bocasana, Turbinicarpus lophophoroides, T. schmiedickeanus var. shwarzii y T. pseudopectinatus) in twelve different basal culture media. We found it is necessary to optimize culture conditions for each individual species, as we did in this study. The compositions of the different media affected the hairy root morphology, which can suggest differences in secondary metabolite production in these hairy root lines. To decrease labor and consumable costs, we evaluated the production of biomass between species cultured in semisolid medium and the temporary immersion system RITA®. There was not a significant difference between these treatments, but hairy roots grown in bioreactors showed a homogenous morphology and did not generate callus tissue. Shoots were regenerated from hairy root cultures spontaneously. We managed to multiply these shoots in vitro and grow them in greenhouse conditions. These plants will allow us to study the morphology and other aspects of cacti regenerated plants in future investigations. We confirmed the successful

transformation of the hairy roots by Agrobacterium rhizogenes with a GUS histochemical analyses, observing an intense blue coloration in the transformed tissues of the established hairy root cultures. There were differences in GUS activity when comparing transformed roots and shoots (normal and vitrified) of E. chaffeyii, Turbinicarpus laui y T. pseudopectinatus generated from the latter by a fluorometric assay. We observed great variation of GUS enzyme activity among the three species tested, E. chaffeyii had the highest activity. Transformed roots showed higher GUS activity than the regenerated plants. We also confirmed the transfer of T-DNA from A. rhizogenes to the plant genome by amplifying the rolB, nptII and gus genes by PCR. We also determined it was not bacterial contamination by amplifying the vir gene which is found outside the TDNA region, so it should not be present in transformed plant tissues free of A. rhizogenes. Betacianins, betaxanthins and betalamic acid were detected in some cacti species. We found significant concentrations of betalamic acid in most species. The effect of basal culture media in betalain production was assessed in Turbinicarpus laui. Betacianin concentration was higher when hairy roots were cultured in DKW medium an lower in WPM medium. We identified hordenine, the most common alkaloid-type compound in cacti, in most species studied by gas chromatography-mass spectrometry. We also identified some beta-phenetylamines, also compounds of pharmacological interest. The total extract of transformed roots did not show antibacterial activity in the pathogenic bacteria E. coli. This study contributes to the conservation and rational conservation of many Mexican cacti species by providing a method to obtain useful compounds in a sustainable manner, by using transformed roots instead of collecting specimens from the wild. Also, this study opens several lines of investigation on the subject, one of the most interesting being the scaling-up of root cultures in bioreactors and the generating of complete transgenic plants.