RESUMEN
Se transformaron explantes axénicos de veinticinco especies de la
familia Cactaceae con la cepa de tipo agropina de Agrobacterium
rhizogenes A4 con el plásmido ESC4 que contienen los genes nptII y gus para
establecer cultivos de raíces transformadas. Se evaluó la eficiencia de
trasformación de dichas especies en diferentes concentraciones del medio
basal de cultivo MS (100, 75, 50 y 25%), las cuales mostraron una gran variación
incluso entre miembros del mismo género. La mayoría de las especies alcanza
su pico de crecimiento máximo a los 30 o 45 días de cultivo, llegando a una
fase estacionaria. La fase estacionaria de la mayoría de las especies tuvo una
duración de varios meses, por lo que los cultivos de raíces transformadas se
lograron establecer hasta después de cuatro a seis meses en la mayoría de las
especies. Los cultivos establecidos de raíces transformadas de Turbinicarpus
lophophoroides se cultivaron bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 de
obscuridad donde mostraron un mayor incremento de biomasa comparado
con su cultivo en obscuridad permanente. Se probó la espuma de poliuretano
como soporte alternativo en el cultivo de raíces transformadas, el cual resultó
en crecimiento semejante al obtenido en raíces cultivadas en agar.
Se evaluó la producción de biomasa de seis especies de cactáceas
(Escobaria chaffeyi, Ferocactus peninsulae Mammillaria bocasana var.
bocasana, Turbinicarpus lophophoroides, T. schmiedickeanus var. shwarzii y T.
pseudopectinatus) en doce medios basales de cultivo diferentes. Se encontró
que es necesario optimizar el tipo y concentración del medio de cultivo basal
para cada especie estudiada, como se llevó a cabo en este estudio. La
composición de los diferentes medios de cultivo afectó la morfología de las
raíces transformadas, lo que también puede sugerir diferencias en la
producción de metabolitos secundarios en estas líneas de raíces pilosas. Con a
finalidad de disminuir costos de labor y de consumible se evaluó la
producción de biomasa entre las de raíces transformadas cultivadas en medio
de cultivo semisólido y en el sistema de inmersión temporal RITA®. No hubo
diferencia significativa entre los dos tratamientos, sin embargo, las raíces
presentaban morfología homogénea y no generaron tejido calloso. Se
generaron brotes a partir de los cultivos de raíces transformadas de manera
espontánea. Se logró multiplicar estos brotes y aclimatarlos a condiciones de
invernadero. Esto con la única finalidad de realizar estudios posteriores con
este material vegetal. Mediante el análisis histoquímico para la actividad de
GUS se confirmó la transformación exitosa de las raíces presuntamente
transformadas mediante A. rhizogenes, observándose una coloración azul
intensa en todos los tejidos presuntamente transformados de los cultivos ya
establecidos de raíces transformadas. Se observaron diferencias en la
actividad de GUS al comparar raíces transformadas y brotes (normales y
vitrificados) de E. chaffeyii, Turbinicarpus laui y T. pseudopectinatus generados
a partir de éstas mediante un ensayo fluorométrico. Se observó gran variación
de la actividad de la enzima GUS entre las tres especies estudiadas, siendo E.
chaffeyii la de mayor actividad. Las raíces transformadas mostraron mayor
actividad de GUS que los brotes. Con la técnica PCR se confirmó la
transferencia del T-DNA de A. rhizogenes al genoma de la planta amplificando
los genes rolB, nptII y gus. También se aseguró que no se tratara del ADN de la
bacteria analizando la presencia del gen vir que se encuentra fuera del T-DNA,
por lo que no debe estar presente en tejidos vegetales transformados libres de
A. rhizogenes.
Se detectaron betacianinas, betaxantinas y ácido betalámico en
algunas especies de cactáceas. Se encontraron concentraciones significativas
de ácido betalámico, precursor de estos pigmentos, en la mayoría de las
especies. El contenido de betaxantinas es bajo en la mayoría de las especies,
excepto en Escobaria chaffeyii donde fue aproximadamente 0.05 mg/g de
peso fresco. El contenido de betacianinas fue mayor en Turbinicarpus
lophophoroides, E. chafeyii y T. laui, lo que coincide con el contenido de ácido
betalámico en estas especies. Se analizó el efecto del medio de cultivo sobre
la producción de betalaínas en raíces transformadas de T. laui. La
concentración de betacianinas fue mayor cuando se cultivaron en medio
DKW y menor en medio WPM. Los diferentes medios de cultivo no modificaron
la producción de betaxantinas en T. laui. Mediante la cromatografía de gases
acoplada a espectrometría de masas se logró identificar al compuesto de tipo
alcaloide más común en muchas especies de cactáceas, la hordenina, en la
mayoría de las especies estudiadas. También se identificaron algunas betafenetilaminas,
ambos compuestos son de interés farmacológico. El extracto
total de raíces transformadas de T. lophophoroides no se presentó actividad
bactericida ante la bacteria patógena E. coli.
Este estudio contribuye a la conservación y explotación racional de
varias especies de cactáceas mexicanas al proveer un método para obtener
compuestos útiles de una manera sustentable, o sea utilizando raíces
transformadas en lugar de colectar ejemplares en su hábitat silvestre. Además,
abre varias posibles líneas de investigación sobre el tema, siendo algunas de
las más interesantes el escalamiento de los cultivos de raíces transformadas a
biorreactores y la posibilidad de generar plantas transgénicas completas.
ABSTRACT
Axenically grown explants of twenty-five species of the family
Cactaceae were inoculated with an Agrobacterium rhizogenes A4 agropinetype
strain carrying the ESC4 plasmid, which contains the nptII and gus genes.
The transformation efficiency of all species when cultured on different MS basal
media concentrations (100, 75, 50 and 25%) showed great variation, even
between members of the same genus. Most species reach their maximum
growth at thirty to forty days of culture, reaching a stationary phase. The latter
lasted for several months for most species, thus, hairy root cultures were
established until after four to six months. Established hairy roots cultures of
Turbinicarpus lophophoroides were cultured under a photoperiod of 16 hours of
light and 8 hours of darkness, best growth was achieved under light:dark
conditions. Polyurethane foam was tested as an alternative for hairy root
culture, which resulted in similar growth to the one obtained in roots grown in
agar.
Biomass production was assessed for six cacti species (Escobaria
chaffeyi, Ferocactus peninsulae Mammillaria bocasana var. bocasana,
Turbinicarpus lophophoroides, T. schmiedickeanus var. shwarzii y T.
pseudopectinatus) in twelve different basal culture media. We found it is
necessary to optimize culture conditions for each individual species, as we did
in this study. The compositions of the different media affected the hairy root
morphology, which can suggest differences in secondary metabolite
production in these hairy root lines. To decrease labor and consumable costs,
we evaluated the production of biomass between species cultured in semisolid
medium and the temporary immersion system RITA®. There was not a significant
difference between these treatments, but hairy roots grown in bioreactors
showed a homogenous morphology and did not generate callus tissue. Shoots
were regenerated from hairy root cultures spontaneously. We managed to
multiply these shoots in vitro and grow them in greenhouse conditions. These
plants will allow us to study the morphology and other aspects of cacti
regenerated plants in future investigations. We confirmed the successful
transformation of the hairy roots by Agrobacterium rhizogenes with a GUS
histochemical analyses, observing an intense blue coloration in the transformed
tissues of the established hairy root cultures. There were differences in GUS
activity when comparing transformed roots and shoots (normal and vitrified) of
E. chaffeyii, Turbinicarpus laui y T. pseudopectinatus generated from the latter
by a fluorometric assay. We observed great variation of GUS enzyme activity
among the three species tested, E. chaffeyii had the highest activity.
Transformed roots showed higher GUS activity than the regenerated plants. We
also confirmed the transfer of T-DNA from A. rhizogenes to the plant genome by
amplifying the rolB, nptII and gus genes by PCR. We also determined it was not
bacterial contamination by amplifying the vir gene which is found outside the TDNA
region, so it should not be present in transformed plant tissues free of A.
rhizogenes.
Betacianins, betaxanthins and betalamic acid were detected in some
cacti species. We found significant concentrations of betalamic acid in most
species. The effect of basal culture media in betalain production was assessed
in Turbinicarpus laui. Betacianin concentration was higher when hairy roots
were cultured in DKW medium an lower in WPM medium. We identified
hordenine, the most common alkaloid-type compound in cacti, in most species
studied by gas chromatography-mass spectrometry. We also identified some
beta-phenetylamines, also compounds of pharmacological interest. The total
extract of transformed roots did not show antibacterial activity in the
pathogenic bacteria E. coli.
This study contributes to the conservation and rational conservation of
many Mexican cacti species by providing a method to obtain useful
compounds in a sustainable manner, by using transformed roots instead of
collecting specimens from the wild. Also, this study opens several lines of
investigation on the subject, one of the most interesting being the scaling-up of
root cultures in bioreactors and the generating of complete transgenic plants.
