Desarrollo de un sistema de propagación in vitro y transformación genética en plantas de moringa (Moringa oleifera Lam)

Abstract

RESUMEN. Se logró la propagación in vitro de Moringa oleífera a partir de ápices tomados de plántulas de 3-4 cm de longitud. Éstos se colocaron en medio basal MS, donde se generaron brotes cuyos segmentos nodales fueron repetidamente subcultivados en medio MS suplementado con 4.44 μM de Benziladenina (BA). Los resultados obtenidos mostraron que cerca del 90% de los explantes apicales cultivados sin la adición de reguladores del crecimiento respondieron satisfactoriamente formando de 4-5 secciones internodales y generando raíces. Por su parte, el 80% de los explantes nodales cultivados en presencia de BA formaron brotes múltiples. Por lo anterior, es posible el establecimiento de cultivos in vitro de plantas de moringa, donde cada explante tiene una alta capacidad de formar nuevos brotes, sin la necesidad de añadir reguladores de crecimiento exógenos. Por otro lado, se probó el efecto de tratamientos con citocininas (BA) y auxinas (ANA) en segmentos de hipocotilo. En varias de las combinaciones analizadas se observó la producción de tejido calloso y de brotes adventicios. Con esto último se probó la posibilidad de regenerar esta especie a través de la organogénesis. Finalmente, se evaluaron tres métodos de transformación genética en explantes de moringa: a) A. rhizogenes; b) A. tumefaciens, y; c) bombardeo. Primeramente nos basamos en protocolos ya establecidos para otras especies de plantas; sin embargo las condiciones para cada sistema de transformación se fueron modificando, conforme se avanzó en la metodología. El objetivo de este trabajo consistió en la evaluación de los sistemas de transformación para probar si Moringa oleifera era factible de transformar. Para la transformación mediada por A. rhizogenes en explantes de hipocotilo de moringa se utilizó la cepa A4, con el vector binario pESC4; se obtuvieron 81 raíces presuntamente transformadas, con un promedio de 2-4 raíces por explante. La transformación fue confirmada mediante el ensayo histoquímico de β-glucoronidasa; donde el 48% de las raíces presentaron actividad del gen gus. Para la transformación mediada por A. tumefaciens en explantes de hipocotilo de moringa se utilizó la cepa LBA 4404 portando el plásmido binario pBI121, se obtuvieron 16 brotes presuntamente transformados, donde el 31% mostraron actividad del gen gus. La transformación por bombardeo se realizó en tallo, callos y brotes de callos de moringa. Se utilizó el plásmido pAHC25 que contiene un gen reportero (gus) y un gen de selección (BAR) que le confiere resistencia al herbicida BASTA, por lo cual se realizó previamente un ensayo de susceptibilidad a este herbicida. Con este método de transformación no se observaron resultados positivos.

ABSTRACT. The in vitro propagation of Moringa oleifera from apexes taken from seedlings 3-4 cm in length was achieved. These were placed on MS basal medium, where shoots were generated. Nodal segments of these shoots were repeatedly subcultured on MS medium supplemented with 4.44 μM benzyladenine (BA). The results showed that about 90% of the apical explants cultured without addition of growth regulators responded satisfactorily forming 4-5 internodal sections and generating roots. For its part, 80% of the nodal explants cultured in the presence of BA formed multiple shoots. Therefore, it is possible to establish in vitro cultures of moringa plant, where each explant has a high ability to form new shoots, without the need to add exogenous growth regulators. Furthermore, the effect of treatments with cytokinin (BA) and auxin (NAA) in hypocotyl segments was proven. In several combinations tested, production of callus and adventitious shoots were observed. With this the possibility of regenerating the species through organogenesis was proven. Finally, three methods for genetic transformation of moringa explants were evaluated: a) A. rhizogenes; b) A. tumefaciens, and; c) bombardment. First we rely on protocols established for other plant species; however the conditions for each transformation system were modified, as advanced in the methodology. The objective of this work consists in the evaluation of the transformation systems to test whether Moringa oleifera was feasible to transform. For A. rhizogenes mediated transformation of moringa hypocotyl explants, A4 strain with the binary vector pESC4 was used; 81 presumably transformed roots were obtained, averaging 2-4 roots per explant. The transformation was confirmed by histochemical assay of β-glucuronidase; where 48% of the roots showed gus gene activity. For transformation mediated by A. tumefaciens in moringa hypocotyl explants, strain LBA 4404 bearing the binary plasmid pBI121 was used, and 16 presumably transformed shoots were obtained, where 31% exhibited GUS activity. Transformation by bombardment was performed on moringa stem, calluses and shoots. The pAHC25 plasmid containing a reporter gene (GUS) and a selection gene (BAR) that confers resistance to the herbicide BASTA, was used. Where by a susceptibility assay to this herbicide previously performed. With this transformation method no positive results were observed.