El objetivo general del trabajo fue determinar los principales mecanismos de remoción y los principales géneros microbianos involucrados en la depuración de cadmio, cromo y mercurio en lagunas de estabilización enriquecidas con bioflóculos. Para determinar la viabilidad de los bioflóculos, se realizaron ensayos de viabilidad sobre la biomasa tratada con metales pesados, empleando el Kit vida muerte de Molecular Probes, una vez realizadas las pruebas de viabilidad se procedió al aislamiento de las bacterias, el cual se llevó a cabo empleando agar BHI enriquecido con 100 mg/L de cada metal (Cd, Cr y Hg) y BHI libre de metales para microorganismos provenientes de bioflóculos provenientes de lagunas control. Una vez verificada la viabilidad de la biomasa, se procedió a la identificación, la cual se llevó a cabo primero empleando pruebas bioquímicas (galerías Api NE y Api E, Biomériéux), y posteriormente se corroboró la identificación empleando técnicas de secuenciación de rRNA por PCR, utilizando los Primers universales 16s (27f) y 16s (1492R). Por otro lado, se prepararon frotis de los bioflóculos para observar su estructura al microscopio electrónico de barrido, esto consistió en fijar los bioflóculos al aire en portaobjetos, deshidratarlos con soluciones crecientes de alcohol para finalmente cubrirlos con oro y realizar la observación y toma de micrografías de los bioflóculos. Se tomaron muestras de sedimentos de las lagunas enriquecidas y alimentadas con cada uno de los metales, y de la laguna control no enriquecida y tratada con metales pesados para determinar la concentración de metales pesados en el sedimento completo y se procuró separar la fracción inorgánica (cristales) de la orgánica (biomasa) por medio de sedimentación, a fin de determinar la concentración de metales en cada una de estas dos fracciones por separado. Se realizaron experimentos por lote (500 mL) utilizando biomasa tindalizada y sin tindalizar de las lagunas enriquecidas, con la finalidad de estudiar la importancia de los mecanismos abióticos de remoción de los metales en estos sistemas. De acuerdo con los resultados obtenidos observando se observó que la alimentación de elevadas concentraciones de metales no provocó efectos tóxicos significativos en la biomasa de las lagunas enriquecidas con bioflóculos. En todos los casos, la viabilidad fue del orden del 90%, similar a la observada en la biomasa antes de la alimentación de los metales. Se aislaron y caracterizaron diez cepas bacterianas en las lagunas enriquecidas con bioflóculos antes de la alimentación con metales en contraste, posterior a la alimentación con metales pesados, se identificaron sólo dos cepas en el caso del Cd, cuatro para el Cr y tres para el Hg, siendo en la mayoría de los casos diferentes a las previamente identificadas. La observación de la estructura de los bioflóculos empleando un microscopio electrónico de barrido mostró notables similitudes con la conformación presentada por las biopelículas, incluyendo canales para el paso de agua y nutrientes, con la excepción de que los bioflóculos no están adheridos a superficie alguna. Los resultados obtenidos en los estudios sobre la biomasa sedimentada muestran que en todos los casos se observó una concentración significativa de metales pesados (entre el 24 y el 76%) tanto en la fracción orgánica (biomasa) como en la inorgánica (cristales); lo cual implica que para todos los metales estudiados, en ambos tipos de laguna, los mecanismos de remoción asociados a la inmovilización de los metales en la biomasa (bioadsorción, bioquimioadsorción y bioacumulación), y los mecanismos asociados a la precipitación del metal (bioprecipitación, biotrasformación y biomineralización), fueron ambos relevantes, inmovilizando en los sedimentos al menos cerca de la cuarta parte del metal removido del agua residual. La información obtenida de los experimentos por lote, para los tres metales ensayados (Cd, Cr, y Hg); muestran que la biomasa tindalizada presenta una importantes remoción del metal sin embargo, conforme se siguió alimentando el metal, dejó de remover significativamente los metales. Estos resultados muestran un patrón de saturación en la biomasa tindalizada, que está ausente en la biomasa experimental activa; lo cual hace evidente que los procesos fundamentales que mantienen una elevada eficiencia en la remoción de los metales en las lagunas de estabilización enriquecidas son de naturaleza biológica. La remoción de los metales se debió casi en su totalidad a la actividad de la biomasa sedimentada (bioflóculos). Experimentos por lote demostraron que la biomasa suspendida (sobrenadante de las lagunas) no contribuye de manera significativa a la remoción de los metales. En todos los casos, la remoción por los sobrenadantes fue similar al experimento control. Esto descarta la contribución significativa de la precipitación química debido a los componentes del agua residual sintética, y también la bioprecipitación debida a metabolitos presentes en la masa líquida; no así la bioprecipitación a nivel de los microambientes en el interior de los bioflóculos. Empleando la autofluorescencia de los metales ensayados, los cuales generan una señal muy clara en el microscopio de epifluorescencia, fue posible localizar los metales inmovilizados en la biomasa de las lagunas enriquecidas con bioflóculos. Los experimentos control, empleando biomasa libre de metales, no mostraron señal alguna de fluorescencia; lo cual descarta la interferencia de los componentes del agua residual sintética y de la biomasa misma. En contraste, para los tres metales estudiados (Cd, Cr y Hg) fue posible confirmar la presencia de los metales inmovilizados tanto en la biomasa como en los microcristales incorporados a los bioflóculos.
The overall objective was to determine the main removal mechanisms and major microbial genres involved in the purification of cadmium, chromium, and mercury in stabilized ponds enriched with bioflocks. In order to determine the viability of bioflocks, viability tests were performed over the biomass treated with heavy metals. The Molecular Probes life death kit was used. Once the viability tests were done, the bacteria were isolated. This was done by using BHI agar enriched with 100 mg/L of each metal (Cd, Cr, and Hg) and metal-free BHI for microorganisms of bioflocks originating from control ponds. Identification proceeded once the biomass viability was verified. This was done, first, by using biochemical tests (Api NE and Api E galleries, bioMériux) and, later, identification was confirmed through rRNA PCR sequencing techniques, using 16s (27f) and 16s (1492R) universal primers. Furthermore, smear bioflocks were prepared for observation of their structure through scanning electron microscopy. This consisted of placing the bioflocks on slides for proper ventilation, then dehydrating them with increasing alcohol solutions, to finally cover them with gold and perform the observation and the taking of micrographs from the bioflocks. Sediment samples were taken from enriched and fed ponds with each of the metals and from the non-enriched control pond, treated with heavy metals, to determine the concentration of heavy metals in the entire sediment; seeking to separate the inorganic fraction (crystals) from the organic (biomass) through sedimentation in order to determine the metals concentration in each of these two fractions separately. Batch experiments (500mL) were performed using sterilized and non-sterilized biomass from enriched ponds to be able to study the importance of abiotic mechanisms for the removal of metals in these systems. According to the obtained results, it was observed that the feeding of high metal concentrations caused no significant toxic effects on the biomass of ponds enriched with bioflocks. In all cases, viability was approximately 90%, which is similar to that observed in the biomass prior to the feeding of metals. Ten bacterial strains were isolated and characterized in the ponds enriched with bioflocks before the feeding of metals in contrast. After the feeding of heavy metals, only two strains were identified for Cd, four for Cr, and three for Hg; in most cases these were different from the previously identified. The bioflocks structure observation done using the scanning electron microscope showed remarkable similarities to the structure presented by the biofilms, including canals for the passage of water and nutrients, with the exception that bioflocks are not stuck to any surface. The results obtained from the sediment biomass studies showed that in all cases there is a significant concentration of heavy metals (between 24% and 26%) in the organic fraction (biomass), as well as in the inorganic (crystals); implying that for all metals studied, in both types of ponds, the removal mechanisms associated with the immobilization of metals in biomass (biosorption, biochemicalsorption, and bioaccumulation) and the mechanisms associated with the precipitation of metal (bioprecipitation, biotransformation, and biomineralization) were both relevant, immobilizing within the sediments, at least, about a quarter of the removed metal from wastewater. The information obtained from the batch experiments from the three tested metals (Cd, Cr, and Hg) show that the sterilized biomass presents a major metal removal; however, as the metal continued to be fed, the removal of metals significantly ceased. These results show a saturation pattern in the sterilized biomass, which is absent in the active experimental biomass; this clearly represents that the fundamental processes that maintain a high efficiency in the removal of metals in the ponds with enriched stabilization are biological in nature. The removal of metals was due, almost entirely, to the sediment biomass (bioflocks) activity. Batch experiments showed that the suspended biomass (supernatant ponds) does not contribute significantly with the removal of metals. In all cases, the removal through supernatants was similar to that of the control experiment. This eliminates the significant contribution of chemical precipitation due to the components of synthetic wastewater and the bioprecipitation due to the metabolites present in liquid mass; nevertheless, the bioprecipitation at a level of the microenvironments in the interior of the bioflocks. By using the autofluorescence microscope, it was possible to locate the immobilized metals in the biomass of the ponds enriched with bioflocks. The control experiments, using free-biomass metals, showed no fluorescence signal; this rule out the interference of synthetic wastewater components and the biomass itself. In contrast, it was possible to confirm the presence of immobilized metals in the biomass, as well as in the microcrystals incorporated in the bioflocks, for the three metals studied (Cd, Cr, and Hg.)
