RESUMEN:
Actinobacillus pleuropneumoniae (App) es una bacteria Gram-negativa distribuida globalmente que produce pleuroneumonía porcina. Estudios previos de nuestro grupo de investigación detectan reactividad cruzada de extractos proteicos totales de App con el anticuerpo anti-Vat, concretamente con lo que podría ser AasP, además de la formación de vacuolas en interacciones celulares in vitro. La proteína de membrana AasP de Actinobacillus pleuropneumoniae (App) y la toxina autotransportadora vacuolante (Vat) de Enterobacteriaceae pertenecen a la gran familia de los autotransportadores; ambas proteínas son serina proteasas, mientras que VacJ es una lipoproteína que se le ha atribuido formación de vacuolas en interacciones celulares. En este estudio se realizó un análisis in silico para determinar la posible función y estructura de AasP y VacJ, la identificación de la presencia de los genes de las proteínas AasP y VacJ en serotipos 4074, JL03, L20 y AP76 (1, 3, 5 y 7 respectivamente) de App mediante PCR, estudios de similitud e identidad con la proteína Vat tanto in silico como in vitro para corroborar la existencia de reactividad cruzada entre AasP y VacJ con el anticuerpo anti-Vat además de determinar la presencia de las proteínas AasP y VacJ de App en interacciones celulares. El análisis in silico de la proteína AasP encontró similitud con genes de Mannheimia granulomatis y Actinobacillus lignirenssi y se predice pudiera tener función hidrolasa o función de escindir otras proteias, para VacJ se encontró similitud con lipoproteínas de la familia MlaA de A. lignirenssi, A, equuli y A. urease con posible función en el mantenimiento de la asimetría lipídica, trasportador de proteína u oxidorreductasa. Se identifican genes de las proteínas AasP y VacJ en los cuatro serotipos de App. Se encontró una identidad del 31.2% para AasP y de 20.5% para VacJ en el alineamiento de proteínas con Vat. La inmunotransferencia revela bandas de 100 y 75 kDa en los serotipos 1, 3, 5b y 7 en condiciones de aerobiosis, anaerobiosis y restricción de hierro. La secuenciación LC-MS de la banda de 100 kDa identifica la serina peptidasa de la familia S8 (AasP). Las interacciones celulares muestras la presencia de los genes de las proteínas AasP y VacJ.
ABSTRACT:
Actinobacillus pleuropneumoniae (App) is a globally distributed Gram-negative bacterium that causes swine pleuropneumonia. Previous studies by our research group detect cross-reactivity of total protein extracts of App with the anti-Vat antibody, specifically with what could be AasP, in addition to the formation of vacuoles in cellular interactions in vitro. The membrane protein AasP from Actinobacillus pleuropneumoniae (App) and the vacuolating autotransporter toxin (Vat) from Enterobacteriaceae belong to the large family of autotransporters; both proteins are serine proteases, while VacJ is a lipoprotein that has been attributed to vacuole formation in cellular interactions. In this study, an in silico analysis was performed to determine the possible function and structure of AasP and VacJ, identifying the presence of the AasP and VacJ protein genes in serotypes 4074, JL03, L20 and AP76 (1, 3, 5 and 7 respectively) of App by PCR, similarity and identity studies with the Vat protein both in silico and in vitro to corroborate the existence of cross-reactivity between AasP and VacJ with the anti-Vat antibody in addition to determining the presence of the AasP proteins and App VacJ in cellular interactions. The in silico analysis of the AasP protein found similarities with genes from Mannheimia granulomatis and Actinobacillus lignirenssi. It is predicted that it could have a hydrolase function or function of cleaving other proteins. For VacJ, similarity was found with lipoproteins of the MlaA family of A. lignirenssi, A, equuli, and A. urease with possible function in the maintenance of lipid asymmetry, protein transporter, or oxidoreductase. Genes for the AasP and VacJ proteins are identified in the four serotypes of App. An identity of 31.2% for AasP and 20.5% for VacJ was found in the alignment of proteins with Vat. The immunoblot reveals 100 and 75 kDa bands in the serotypes 1, 3, 5b, and 7 under aerobiosis, anaerobiosis, and iron restriction conditions. LC-MS sequencing of the 100 kDa band identifies the S8 family serine peptidase (AasP). Cellular interactions show the presence of the AasP and VacJ protein genes.
