Estudio del efecto del glicomacropéptido sobre la respuesta in vitro del queratinocito al microambiente tisular de la dermatitis atópica

Abstract

Resumen El queratinocito (KC) es el principal componente funcional y estructural de la epidermis, la capa más externa de la piel. La epidermis está altamente especializada en la defensa contra agentes externos y en evitar la pérdida de agua transepidermal. La barrera epidérmica alterada y la diferenciación aberrante del KC están involucradas en la fisiopatología de varias enfermedades de la piel, como la dermatitis atópica (DA). La DA es una condición alérgica, ampliamente distribuida en todo el mundo y para la que todavía no hay cura. Se trata de una enfermedad inflamatoria crónica de la piel generada por la interacción entre factores genéticos y ambientales y caracterizada por una respuesta inmunitaria sesgada hacia el perfil tipo 2. Los pacientes con DA presentan una reducción de la diversidad microbiana en la piel con un aumento de Staphylococcus spp. Durante la DA activa hay colonización de la piel lesionada con la bacteria oportunista Staphylococcus aureus que generalmente se mantiene en equilibrio gracias a la presencia de bacterias comensales como Staphylococcus epidermidis. El glicomacropéptido (GMP) es un péptido bioactivo derivado de la k-caseína de la leche que se genera por la acción enzimática de la pepsina o la quimosina. Tiene propiedades antialérgicas y restauradoras de la barrera cutánea cuando se administra por vía oral en la DA experimental. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del GMP en las respuestas inflamatorias, oxidativas, proliferativas y migratorias de los KCs HaCaT en un modelo de DA in vitro. Además, se analizó el efecto del GMP sobre el crecimiento de S. aureus y S. epidermidis en cultivo, así como sobre la adhesión de ambas bacterias a las células HaCaT en cultivo. Se observó que el GMP protegió a los KCs de la muerte y la apoptosis de forma dependiente de la concentración. El GMP a 6.3 y 25 mg/mL, respectivamente, redujo la producción de óxido nítrico en un 50 % y 83.2 %, así como los lípidos hidroperóxidos en un 27.5 % y 45.18 % en células HaCaT activadas. Mediante el tratamiento con GMP la expresión génica de TSLP, IL33, TARC, MDC y NGF se regularon significativamente a la baja al compararse contra el control en KCs activados, mientras que se potenció la expresión de cGRP. Finalmente, en un microambiente de DA, el GMP a 25 mg/mL estimuló la proliferación de células HaCaT, mientras que concentraciones de 0.01 y 0.1 mg/mL promovieron la migración de las células. En ensayos in vitro, el GMP a 6.3 mg/mL estimuló el crecimiento de S. epidermidis un 49% y el de S. aureus solo en un 25%. Además, el GMP inhibió la adhesión de S. aureus a los KCs en cultivo de una manera dependiente de la concentración, llegando a reducir en un 96.9% la adhesión de la bacteria a las células HaCaT a la concentración de 6.3 mg/mL. Contrariamente, el GMP aumentó la adhesión de S. epidermidis a los KCs, siendo este efecto inversamente proporcional a la cantidad de GMP añadido al medio. Por lo tanto, con este trabajo demostramos que el GMP tiene propiedades antiinflamatorias y antioxidantes en los KCs, estimula el cierre de heridas en un modelo in vitro de DA y disminuye la adhesión de la bacteria oportunista S. aureus a las células HaCaT, reforzando la evidencia del GMP como un candidato terapéutico potencial para la DA por su efecto benéfico sobre los KCs.

Abstract The keratinocyte (KC) is the main functional and structural component of the epidermis, the outermost layer of the skin. The epidermis is highly specialized in defending against external agents and preventing transepidermal water loss. Disrupted epidermal barrier and aberrant KC differentiation are involved in the pathophysiology of several skin diseases, such as atopic dermatitis (AD). AD is an allergic condition, widely distributed throughout the world and for which there is still no cure. It is a chronic inflammatory skin disease generated by the interaction between genetic and environmental factors and characterized by an immune response biased towards the type 2 profile. Patients with AD present a reduction in microbial diversity on the skin with an increase in Staphylococcus spp. During active AD there is colonization of the injured skin with the opportunistic bacteria Staphylococcus aureus, which is generally maintained in balance thanks to the presence of commensal bacteria such as Staphylococcus epidermidis. Glycomacropeptide (GMP) is a bioactive peptide derived from milk κ-casein that is generated by the enzymatic action of pepsin or chymosin. It has anti-allergic and skin barrier restorative properties when administered orally in experimental AD. This study aimed to evaluate the effect of GMP on the inflammatory, oxidative, proliferative and migratory responses of HaCaT KCs in an in vitro AD model. Furthermore, the effect of GMP on the growth of S. aureus and S. epidermidis in culture, as well as on the adhesion of both bacteria to HaCaT cells in culture, was analyzed. GMP protected KCs from death and apoptosis in a dose dependent manner. GMP at 6.3 and 25 mg/mL, respectively, reduced nitric oxide by 50% and 83.2% as well as lipid hydroperoxides by 27.5% and 45.18% in activated HaCaT cells. The gene expression of TSLP, IL33, TARC, MDC, and NGF was significantly downregulated comparably to control by GMP treatment in activated KCs, while that of cGRP was enhanced. Finally, in an AD microenvironment, GMP at 25 mg/mL stimulated HaCaT cell proliferation, while concentrations of 0.01 and 0.1 mg/mL promoted the HaCaT cell migration. In in vitro assays, GMP at 6.3 mg/mL stimulated the growth of S. epidermidis by 49% and that of S. aureus by only 25%. Furthermore, GMP inhibited the adhesion of S. aureus to the KCs in culture in a concentration-dependent manner, reducing the adhesion of the bacteria to the HaCaT cells by 96.9% at the concentration of 6.3 mg/mL, this effect being inversely proportional to the amount of GMP added to the medium Therefore, we demonstrate that GMP has anti-inflammatory and antioxidative properties and stimulates wound closure on an AD model of KCs and decreases the adhesion of the opportunistic bacteria S. aureus to HaCaT cells. reinforcing the evidence of GMP as a potential therapeutic candidate for AD due to its beneficial effect on KCs