Resumen
El queratinocito (KC) es el principal componente funcional y estructural de la epidermis,
la capa más externa de la piel. La epidermis está altamente especializada en la defensa
contra agentes externos y en evitar la pérdida de agua transepidermal. La barrera
epidérmica alterada y la diferenciación aberrante del KC están involucradas en la
fisiopatología de varias enfermedades de la piel, como la dermatitis atópica (DA). La DA
es una condición alérgica, ampliamente distribuida en todo el mundo y para la que
todavía no hay cura. Se trata de una enfermedad inflamatoria crónica de la piel generada
por la interacción entre factores genéticos y ambientales y caracterizada por una
respuesta inmunitaria sesgada hacia el perfil tipo 2. Los pacientes con DA presentan una
reducción de la diversidad microbiana en la piel con un aumento de Staphylococcus spp.
Durante la DA activa hay colonización de la piel lesionada con la bacteria oportunista
Staphylococcus aureus que generalmente se mantiene en equilibrio gracias a la presencia
de bacterias comensales como Staphylococcus epidermidis. El glicomacropéptido (GMP)
es un péptido bioactivo derivado de la k-caseína de la leche que se genera por la acción
enzimática de la pepsina o la quimosina. Tiene propiedades antialérgicas y restauradoras
de la barrera cutánea cuando se administra por vía oral en la DA experimental. El objetivo
de este trabajo fue evaluar el efecto del GMP en las respuestas inflamatorias, oxidativas,
proliferativas y migratorias de los KCs HaCaT en un modelo de DA in vitro. Además, se
analizó el efecto del GMP sobre el crecimiento de S. aureus y S. epidermidis en cultivo, así
como sobre la adhesión de ambas bacterias a las células HaCaT en cultivo. Se observó
que el GMP protegió a los KCs de la muerte y la apoptosis de forma dependiente de la
concentración. El GMP a 6.3 y 25 mg/mL, respectivamente, redujo la producción de óxido
nítrico en un 50 % y 83.2 %, así como los lípidos hidroperóxidos en un 27.5 % y 45.18 %
en células HaCaT activadas. Mediante el tratamiento con GMP la expresión génica
de TSLP, IL33, TARC, MDC y NGF se regularon significativamente a la baja al compararse
contra el control en KCs activados, mientras que se potenció la expresión
de cGRP. Finalmente, en un microambiente de DA, el GMP a 25 mg/mL estimuló la
proliferación de células HaCaT, mientras que concentraciones de 0.01 y 0.1 mg/mL
promovieron la migración de las células. En ensayos in vitro, el GMP a 6.3 mg/mL estimuló
el crecimiento de S. epidermidis un 49% y el de S. aureus solo en un 25%. Además, el GMP
inhibió la adhesión de S. aureus a los KCs en cultivo de una manera dependiente de la
concentración, llegando a reducir en un 96.9% la adhesión de la bacteria a las células
HaCaT a la concentración de 6.3 mg/mL. Contrariamente, el GMP aumentó la adhesión
de S. epidermidis a los KCs, siendo este efecto inversamente proporcional a la cantidad
de GMP añadido al medio. Por lo tanto, con este trabajo demostramos que el GMP tiene
propiedades antiinflamatorias y antioxidantes en los KCs, estimula el cierre de heridas en
un modelo in vitro de DA y disminuye la adhesión de la bacteria oportunista S. aureus a
las células HaCaT, reforzando la evidencia del GMP como un candidato terapéutico
potencial para la DA por su efecto benéfico sobre los KCs.
Abstract
The keratinocyte (KC) is the main functional and structural component of the epidermis,
the outermost layer of the skin. The epidermis is highly specialized in defending against
external agents and preventing transepidermal water loss. Disrupted epidermal barrier
and aberrant KC differentiation are involved in the pathophysiology of several skin
diseases, such as atopic dermatitis (AD). AD is an allergic condition, widely distributed
throughout the world and for which there is still no cure. It is a chronic inflammatory skin
disease generated by the interaction between genetic and environmental factors and
characterized by an immune response biased towards the type 2 profile. Patients with AD
present a reduction in microbial diversity on the skin with an increase in Staphylococcus
spp. During active AD there is colonization of the injured skin with the opportunistic
bacteria Staphylococcus aureus, which is generally maintained in balance thanks to the
presence of commensal bacteria such as Staphylococcus epidermidis. Glycomacropeptide
(GMP) is a bioactive peptide derived from milk κ-casein that is generated by the
enzymatic action of pepsin or chymosin. It has anti-allergic and skin barrier restorative
properties when administered orally in experimental AD. This study aimed to evaluate
the effect of GMP on the inflammatory, oxidative, proliferative and migratory responses
of HaCaT KCs in an in vitro AD model. Furthermore, the effect of GMP on the growth of
S. aureus and S. epidermidis in culture, as well as on the adhesion of both bacteria to
HaCaT cells in culture, was analyzed. GMP protected KCs from death and apoptosis in a
dose dependent manner. GMP at 6.3 and 25 mg/mL, respectively, reduced nitric oxide
by 50% and 83.2% as well as lipid hydroperoxides by 27.5% and 45.18% in activated
HaCaT cells. The gene expression of TSLP, IL33, TARC, MDC, and NGF was significantly
downregulated comparably to control by GMP treatment in activated KCs, while that
of cGRP was enhanced. Finally, in an AD microenvironment, GMP at 25 mg/mL stimulated
HaCaT cell proliferation, while concentrations of 0.01 and 0.1 mg/mL promoted the
HaCaT cell migration. In in vitro assays, GMP at 6.3 mg/mL stimulated the growth of S.
epidermidis by 49% and that of S. aureus by only 25%. Furthermore, GMP inhibited the
adhesion of S. aureus to the KCs in culture in a concentration-dependent manner,
reducing the adhesion of the bacteria to the HaCaT cells by 96.9% at the concentration
of 6.3 mg/mL, this effect being inversely proportional to the amount of GMP added to
the medium Therefore, we demonstrate that GMP has anti-inflammatory and
antioxidative properties and stimulates wound closure on an AD model of KCs and
decreases the adhesion of the opportunistic bacteria S. aureus to HaCaT cells. reinforcing
the evidence of GMP as a potential therapeutic candidate for AD due to its beneficial
effect on KCs
