Obtención y purificación de anticuerpos policlonales específicos contra el contaminante emergente estreptomicina

Abstract

La principal fuente de generación de antibióticos contaminantes, son las aguas residuales de origen hospitalario, y debido a los problemas que se presentan para su eliminación, existe un peligro latente en la generación de cepas bacterianas, de diferentes microorganismos o/y virus resistentes a los antibióticos. Un antibiótico ampliamente utilizado es la estreptomicina (STR, antibiótico aminoglucósidos), la cual se tiene reportado que causa problemas de ototoxicidad y nefrotoxicidad entre otros, en el humano.

Las metodologías más utilizadas para la detección de antibióticos en matrices ambientales requieren el manejo de equipos complejos, costosos, que consumen mucho tiempo en su manejo, además de que su operación no es sencilla. Una opción a este tipo de metodologías, son aquellos basados en interacciones inmunoquímicas. Uno de estos métodos, que han presentado buenos resultados, así como facilidad de desarrollo y alta sensibilidad de detección, son aquellos basados en interacciones inmunológicas entre anticuerpo dirigidos específicamente contra el fármaco. Este tipo de metodologías permite el procesamiento de números elevados de muestras, así como el uso de pequeños volúmenes de la misma, debido a la especificidad que existe entre la interacción antígeno anticuerpo. Es por esto, que este trabajo se enfocó a la obtención y purificación de anticuerpos policlonales específicos contra la STR, los cuales se produjeron bajo un protocolo de inmunización en conejos adultos jóvenes de la cepa Nueva Zelanda, cuya reactividad fue demostrada mediante pruebas de Dot Blot.

El limite más bajo de detección presentado por estos anticuerpos anti-STR, fue de 25 µg/ml (0.0025%). Sin embargo, estos anticuerpos no fueron específicos únicamente contra la STR, sino que presentaron una reacción cruzada contra otros antibióticos aminoglucósidos (kanamicina, neomicina y paromomicina), pero no con antibióticos no aminoglucósidos. Esto lejos de presentar un problema, acarrea la ventaja de un número mayor de moléculas detectables en aguas residuales. Cabe señalar, que la mayoría de los antibióticos aminoglucósidos se utilizan en combinación, por lo cual, el que solo exista la presencia de uno solo en el agua residual no es viable. Al ser los anticuerpos capaces de reconocer otros antibióticos, la utilización de los mismos en pruebas de detección se amplía a un rango que abarca más moléculas de interés. Con los anticuerpos obtenidos en el laboratorio, se logró la detección de STR en agua residual adulterada en el laboratorio. Con esto, se demostró, que las condiciones físicas y químicas no controladas en las que se encuentra el agua, no afecta la reactividad de los anticuerpos ante la STR.

The main source of generation of antibiotics as contaminants, are hospital wastewaters. One of the problems that arise from their disposal, is that they are a potential risk for the generating of bacterial strains and / or viruses resistant to antibiotics. An antibiotic widely used is the streptomycin (STR, aminoglycoside antibiotic), which is reported to cause ototoxicity and nephrotoxicity problems in human.

The methodologies used for the detection of antibiotics in environmental matrices require complex handling, expensive and time-consuming methodologies and equipment, plus the are not simple to operate. An option to such methodologies are those based on immunochemical interactions. One of these methods, which has presented good results, easy development and high detection sensitivity, are those based on immunological interactions between antibody specifically directed against the drug. Such methods allow the processing of large numbers of samples, and the use of small volumes of the same, due to the specificity between the antigen-antibody interaction.

It is for this reason that the aim of this work was to obtain and purificate specific polyclonal antibodies to STR, which occurred under an immunization protocol in young-adult rabbits strain New Zealand, whose reactivity was demonstrated by Dot Blot tests.

The lowest detecting limit presented by these anti-STR, antibodies was 25 mg / ml (0.0025%). However, these antibodies were not specific only against the STR. they presented a cross reaction against other aminoglycoside antibiotics (kanamycin, neomycin, and paromomycin) but not against non-aminoglycoside drugs. This far from presenting a problem, brings the advantage of a greater number of detectable molecules in wastewater. It is noteworthy that most of the aminoglycoside antibiotics are used in combination, therefore, the solely presence of one of them in the wastewater is not viable. As antibodies are capable of recognizing the other aminoglycoside antibiotics, their use in screening is extended to a range that covers more molecules of interest.

With the antibodies raised in our laboratory, the detection of STR in adulterated residual water was achieved. With this, it was shown that the physical and chemical uncontrolled conditions in which the water is located, does not affect the reactivity of the antibodies to the STR.