Evaluación toxicológica subaguda de benzazepina N- sustituida (C9) sobre hígado, riñón y coagulación sanguínea

Abstract

RESUMEN. INTRODUCCIÓN: La creación de fármacos acuaréticos (que sólo evitan la reabsorción de agua sin afectar a los electrolitos), es decir, diuréticos que sólo inducen la excreción de agua libre de solutos, generaría considerables beneficios en casos que cursan con retención de agua como en la insuficiencia cardiaca, cirrosis hepática, SIADH (síndrome de la secreción inapropiada de hormona antidiurética). La benzazepina N- sustituida (C9) es un compuesto no peptídico con sugerida actividad antagónica de receptores de vasopresina u hormona antidiurética, y actualmente se está desarrollando en cuanto a sus propiedades farmacológicas. Dentro del desarrollo de un nuevo fármaco los estudios preclínicos toxicológicos y de seguridad farmacológica son indispensables para garantizar que no se someterá a un riesgo irrazonable en etapas clínicas. En el presente estudio se evaluó el (C9) para determinar, toxicológicamente, el efecto sobre órganos y procesos que pudieran ser el blanco del compuesto, de acuerdo a sus propiedades físico-químicas o bien por su actividad antagónica, tales como su efecto a nivel renal y el equilibrio hidroelectrolítico, hepático y en la coagulación sanguínea (Vía intrínseca - Factor Von Willebrand y vía extrínseca). OBJETIVO: Determinar los efectos de C9 haciendo una evaluación toxicológica subaguda, de dosis-efecto a nivel hepático, renal y en la coagulación sanguínea. MÉTODO: Se utilizaron ratas Wistar machos entre 170 – 220 g., mantenidas en condiciones estándares. Se formaron 5 grupos: Control (solución salina 0.9%) , control DMSO (vehículo), 1, 10 y 20 mg/Kg PC de C9 y se trataron diariamente (IM) durante 15 días. Se tomaron muestras de orina y sangre antes de comenzar los tratamientos y al finalizarlos, para determinar los estados basales y experimentales de las variables. A nivel hepático se evaluó la cantidad de glucógeno, glicemia, así como las enzimas Transaminasa Glutámico Pirúvica (TGP) y la Transaminasa Glutámico Oxalacética (TGO). A nivel renal y del equilibrio hidroelectrolítico se evaluaron las siguientes variables: Sodio, potasio y osmolaridad efectiva sérica; densidad, sodio y potasio urinario, así como el volumen urinario e ingesta de agua en 24 horas. También fueron evaluados algunos biomarcadores de daño tales como: proteinuria, glucosuria, pH, bilirrubina, depuración de creatinina. Para evaluar el efecto en la coagulación sanguínea se determinaron los tiempos de Protrombina (TP) y Tromboplastina (TTPa). Finalmente se realizó un estudio histológico renal y hepático, con tinciones de Hematoxilina – Eosina (H-E) y Periodic Acid Schiff (PAS). ANÁLISIS ESTADÍSTICO: Los datos fueron analizados obteniendo la media +/- EEM, por medio de las pruebas t-student haciendo la comparación entre los estados basales y experimentales para cada uno de los grupos. Además, se hizo una prueba de Dunnet multiple, específicamente en la determinación del glucógeno hepático y tasa de excreción de electrolitos para comparar todos los grupos con el control. Se consideró diferencia significativa si el valor p<0.05. RESULTADOS: No hubo cambios en los biomarcadores de daño renal. En cuanto a daño hepático, se presentó un ligero aumento de la TGP Y TP en la dosis de 20 mg/Kg de C9 lo cual dio un indicio de daño moderado; además de mostrar un aumento de glucógeno, con todas las dosis de C9. El C9 afectó el equilibrio hidroelectrolítico aumentando hasta en un 45 % la excreción de orina e incrementando la osmolaridad efectiva sérica y la concentración de sodio, la cual alcanzó niveles entre 148 a 160 mEq/L con las diferentes dosis de C9; además de generar una disminución en la densidad urinaria, es decir, una orina mas diluida con una excreción de electrolitos (Na+ y K+) normal. No se observaron cambios en el TTPa. En cuanto a los estudios histológicos, no se observaron procesos de daño severo como zonas necróticas y/o apoptóticas, ni presencia de procesos inflamatorios. CONCLUSIONES: A nivel hepático se encontró que el C9 indujo un aumento en la cantidad de glucógeno. Además no mostró efectos tóxicos a excepción de la dosis de 20 mg/Kg, en la cual comenzó a generar un daño moderado, al incrementar la TGP (Transaminasa Glutámico Pirúvica) y TP (Tiempo de Protrombina). El C9 afectó el equilibrio hidroelectrolítico incrementando el volumen urinario, la concentración de Na+ sérico y la osmolaridad efectiva. Disminuyó la densidad urinaria y mantuvo una excreción normal de Na+ y K + urinario, mostrando un efecto “acuarético”, probablemente por su actividad antagónica sobre los receptores V2 renales. El C9 no generó daños en el riñón bajo las condiciones del experimento. El C9 no afecto el Tiempo de Tromboplastina (TTPa), por lo tanto no se ve alterada la liberación del factor Von Willebrand (vía intrínseca).

ABSTRACT INTRODUCTION: The discovery of aquaretic drugs (drugs which avoid water reabsorption and induce urine formation electrolytes free) would give important benefices in several diseases strongly related to water retention, such as: failure congestive heart, hepatic cirrhosis, SIADH (syndrome of inappropriate secretion of antiduiretic hormone), among others. The benzazepine N-substituted (named C9), is a no-peptide compound which suggests an antagonist activity on V1a and V2 vasopressin receptors, and currently it is developing about its pharmacology proprieties. As a part of a new drug development, the toxicological studies as well as safety pharmacology preclinical studies are strictly required for the purpose of guarantee that there will not unreasonable hazards into clinical phases. In this study, the C9 was assessed to determinate toxicological effects on target organs, according whit its physicochemical properties or antagonistic activity, such as renal and hepatic effects: hydro-electrolyte balance and blood clotting (intrinsic and extrinsic pathways). OBJECTIVE: Determinate the effects caused by C9 through a subacute toxicological assessment, dose – effect, in liver, kidney and clotting blood. METHODS: Male Wistar rats (170 – 220 g, body weight) were used in this study, the animals were kept under standard conditions. It make up five groups: Control group (saline solution 0.9%); DMSO control group (vehicle), 1, 10 y 20 mg/Kg b.w. of C9. A single administration (IM) was applied diary, for 15 days. Furthermore, samples of urine and blood were taken to get the basal and experimental stages (before and after treatment). Hepatic glycogen as well as Glutamic Pyruvic Transaminase (GPT) and Glutamic Oxaloacetic Transaminase (GOT) enzymes were assessed. Similary were assessed the following variables: Concentration of sodium and potassium in serum and effective osmolality; density sodium and potassium in urine, as well as volume urine and water intake in 24 hours. Some biomarkers were evaluated, as proteinury, glucosury, pH, bilirrubine and creatinine clearance. With regard to clotting blood, the Prothrombin Time (PT) and active Partial Thromboplastin Time (aPTT) were measured. Finally, a histological study with staining of Hematoxylin –Eosin (H–E) and Periodic Acid Schiff (PAS) was made. STATISTICAL ANALYSIS: Data were analyzed using a t- student test, (values are expressed as mean  SEM); then, a comparison between basal and experimental stages was done. For hepatic glycogen determination and excretion electrolytes (sodium and potassium) rate, a multiple Dunnett test was used (significant difference if value p < 0.05). RESULTS: Respect to hepatic injury, the results showed a slightly increase to GPT and PT in the group 20 mg/Kg b.w.of C9; which gave indication of moderate damage; as well as a glycogen increase under all treatments with C9 (groups: 1, 10 and 20 mg/Kg). The hydro-electrolyte balance was affected by C9, tending to increase the urine excretion till 45 %, as well as the effective osmolality and sodium concentration in blood, which achieved levels from 148 to 160 mEq/L, with all C9 doses (groups: 1, 10 and 20 mg/Kg), this also led a decreasing in density urine, namely, a diluted urine with normal electrolytes (sodium and potassium) excretion. There were no changes in damage renal biomarkers. In the measurement of aPTT, there was no change. Histological studies did not show severe damage, either inflammatory process, necrotic or apoptotic areas. CONCLUTIONS: With regard to hepatic findings, the C9 did not show toxic effects, except to doses of 20 mg/Kg, which provocated moderate damage, inasmuch as increased GPT (Glutamic Pyruvic Transaminase) and PT (Prothrombin Time). In addition the C9 induced increasing of hepatic glycogen. The C9, also affected in the hydro – electrolyte balance, as follows: it increased urine volume, sodium concentration in blood and effective osmolality, it decreased urine density and kept normal excretion of sodium and potassium, namely, generated an “aquaretic” effect, probably for its antagonist activity on renal V2 receptors. The C9 did not lead damage in kidney under experimental conditions. Also, it did not affect the active Partial Thromboplastin Time; therefore, the Von Willebrand factor release was not blocked by C9.