Análisis del perfil de metabolitos presentes en plantas y cultivos in vitro de Coryphantha macromeris y C. potosiana

Abstract

RESUMEN La familia Cactaceae es una de las más amenazadas dentro del reino vegetal y es la más importante en las regiones áridas y semiáridas del Continente Americano. Entre las cactáceas se encuentran especies del género Coryphantha, las cuales poseen actividades farmacológicas y usos en la medicina tradicional mexicana, tal es el caso de Coryphantha macromeris (Engelm.) Britton & Rose y C. potosiana (Jacobi) Glass & Foster. Para estas especies se ha propuesto que las condiciones ambientales de las regiones semiáridas dificultan su germinación, crecimiento y reproducción. En este trabajo se establecieron diferentes sistemas de cultivo in vitro (planta in vitro, cultivo de callos y células en suspensión) de ambas especies y se analizó el perfil de metabolitos presentes en la sección aérea y radicular de plantas aclimatadas y en los cultivos in vitro de C. macromeris. Los cultivos de plantas in vitro se establecieron a partir de semillas germinadas en tubos de cultivo que contenían medio Murashige y Skoog (MS) (30 g L-1 de sacarosa, 10 g L-1 de agar, pH 5.7). Los brotes obtenidos in vitro se utilizaron como fuente de material vegetal para la propagación y aclimatación de las especies a condiciones de invernadero, así como para la inducción de callos y posterior obtención de las suspensiones celulares. Para el análisis del perfil de metabolitos se utilizó cromatografía de líquidos de ultra alta resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem (UHPLC-PDA-HESIOrbitrap- MS/MS). Bajo las condiciones propuestas, se detectaron 44 metabolitos en las plantas in vitro y se identificaron 43 de ellos, mientras que para las plantas de invernadero la diversidad de metabolitos fue mayor, ya que se detectó la presencia de 69 compuestos y 60 fueron identificados. Para ambos casos, los metabolitos que mostraron la mayor abundancia relativa en el cromatograma correspondieron a ácidos orgánicos (ácido cítrico, glucónico y tianshico) y ácidos fenólicos (ácido piscidico, ferúlico y siríngico y/o sus derivados). En el presente trabajo, también se reporta un método eficiente para la inducción de callos friables obtenidos de C. macromeris y C. potosiana, su comportamiento cinético, su escalamiento a nivel matraz, así como el perfil de metabolitos presentes en cada sistema de cultivo. Se establecieron cultivos de callos a partir de secciones transversales inoculadas en medio MS suplementado con 6-bencilaminopurina (BAP; 2.20 μM) y Picloram (4.14 μM). Para C. macromeris, la mayor producción de biomasa (20,65 g DW L-1) se obtuvo a las 9 semanas de cultivo, similar a lo encontrado para C. potosiana. El perfil de metabolitos de los callos de C. macromeris se evaluó en la etapa de mayor producción de biomasa. Los análisis realizados indicaron la presencia de 61 compuestos y se identificaron 52 de ellos. Entre los compuestos detectados, se identificaron 11 ácidos orgánicos, 16 ácidos fenólicos, 8 flavonoides y 17 metabolitos de diferentes clases. Para el establecimiento del cultivo de células en suspensión, se tomaron muestras de tejido calloso con características friables y se transfirieron a matraces de 120 mL que contenían 25 mL de medio MS líquido suplementado con los mismos reguladores de crecimiento (BAP 2.20 μM y Picloram 4.14 μM), y se evaluaron tres velocidades de agitación (80, 100 y 120 rpm) para analizar el efecto de la velocidad de agitación sobre la morfología y viabilidad celular. Nuestros resultados indican que una velocidad de agitación de 120 rpm impacta negativamente en la integridad celular ya que las células sufrieron cambios morfológicos y pérdida de viabilidad. Sin embargo, a 80 y 100 rpm, las células sobrevivieron y proliferaron con éxito con porcentajes de viabilidad similares (aproximadamente 97%). El análisis de perfil de metabolitos presentes en cultivos de células en suspensión se realizó utilizando células de dos meses de edad cultivadas a 80 rpm. Los análisis realizados indicaron la presencia de 49 metabolitos y se identificaron 45 de ellos. Entre los compuestos detectados, se identificaron diferentes clases de metabolitos tales como ácidos fenólicos (derivados del ácido gálico), iridoides (gardósido), estilbenos (tirolobibencil E), lignanos (acantosido B), flavonoides (catequina, lantanosido, sakuranina, afrormosina, kaempferol-7-ramnósido) y feniletanoides, entre otros. Nuestros resultados indican que el perfil de metabolitos de las especies analizadas es afectado por el tipo de cultivo in vitro y contribuyen al conocimiento biotecnológico y fitoquímico de C. macromeris y C. potosiana y sus aplicaciones potenciales en la industria farmacéutica y cosmética, ya que representa una fuente potencial para la obtención de compuestos seleccionados, así como un sistema útil para futuras investigaciones relacionados a la obtención y estudio de metabolitos de alto valor. Además, algunos metabolitos se reportan aquí por primera vez para especies de cactáceas, así como sus patrones de fragmentación.

ABSTRACT The family Cactaceae is one of the most threatened within the plant kingdom and is the most important in the arid and semiarid regions of America. Among Cacti species, the genus Coryphantha is highly endemic and is distributed in the arid and semiarid regions of northern Mexico and southern United States. There are species of the genus Coryphantha, which possess pharmacological activities and uses in folk medicine as is the case of Coryphantha macromeris (Engelm.) Britton & Rose and C. potosiana (Jacobi) Glass & Foster. For this plant species, it has been proposed that the environmental conditions of semiarid regions difficult their germination, growth, and reproduction. In this work, different in vitro culture systems (in vitro plants, callus, and cell suspension cultures) of C. macromeris and C. potosiana were established and then the phytochemical profile of aerial and radicular sections of acclimatized plants and in vitro cultures of C. macromeris was analyzed. In vitro cultures were established from seeds germinated in culture vessels containing Murashige and Skoog (MS) medium (30 g L-1 sucrose, 10 g L-1 agar, pH 5.7). The obtained shoots from the germinating seeds in vitro were used as the source of explants for the in vitro multiplication cycles and for the acclimatization of plants to greenhouse conditions. The phytochemical profile of plants and in vitro cultures was analyzed using ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-PDA-HESI-Orbitrap-MS/MS). Under the proposed chromatographic conditions, 44 metabolites were detected, and 43 of them were identified in in vitro plants. Greenhouse plants showed a higher diversity of compounds since 69 metabolites were detected, and 60 of them were identified. Among detected compounds in plants cultivated in vitro and under greenhouse conditions, organic acids (citric, gluconic and tianshic acids), and phenolic acids such as piscidic, ferulic and syringic acid and/or their derivatives were found as the metabolites with the highest relative abundance. In this work, we also report an efficient method for the induction of friable callus obtained from C. macromeris and C. potosiana, their kinetic behavior, as well as the procedure for the obtention of cell suspension cultures, and the phytochemical profile analyzed in each culture system. Callus cultures were established from stem discs inoculated on MS medium supplemented with 6-benzylaminopurine (BAP; 2.2 μM) and Picloram (4.14 μM). For C. macromeris, the highest yield in biomass production (20.65 g DW L-1) was achieved at 9 weeks of culture, similar to that found for C. potosiana. The chromatographic and mass spectral analysis of the callus tissue obtained from C. macromeris after 9 weeks of culture indicated the presence of 61 metabolites, and 52 of them were identified. Among detected compounds, 11 organic acids, 16 phenolic acids, 8 flavonoids, and 17 metabolites of different classes were identified. The friable callus tissue was then transferred to 120 mL flasks containing 25 mL of MS liquid medium supplemented with the same growth regulators (BAP 2.2 μM and Picloram 4.14 μM), and then three agitation velocities (80, 100 and 120 rpm) were evaluated in order to assess the effect of agitation velocity on cell viability and morphology. Our results indicate that an agitation velocity of 120 rpm impacts negatively on cell integrity since cells suffered morphological changes and loss of viability. Nevertheless, at 80 and 100 rpm, cells successfully survived and proliferated with similar viability percentages (ca. 97%). The phytochemical profile of two-month-old cells cultivated at 80 rpm was then analyzed. The chromatographic and mass spectral analysis indicated the presence of 49 metabolites, and 45 were of them were identified. Among detected compounds, different classes of metabolites such as phenolic acids (gallic acid derivatives), iridoids (gardoside), stilbenes (tyrolobibenzyl E), lignans (acanthoside B), flavonoids (catechin, lantanoside, sakuranin, afrormosin, Kaempferol 7-rhamnoside) and phenylethanoids (phlomisethanoside) were found. Our results suggest that the phytochemical profile of the analyzed species is affected by the type of in vitro culture and contribute to the biotechnological and phytochemical knowledge regarding C. macromeris and C. potosiana and its potential applications in the pharmaceutical and cosmetic industries since it represents a potential source for the obtention of selected compounds, as well a useful system for future investigations regarding the elicitation and study of high valuable metabolites. Besides, some metabolites are reported here for the first time for cacti species as well as their fragmentation patterns.