Evaluación del efecto analgésico y antiinflamatorio de Pereskia sacharosa Griseb en modelos murinos e identificación de compuestos bioactivos

Abstract

Resumen Pereskia sacharosa Griseb se distribuye principalmente en la Amazonía boliviana; en la medicina tradicional es empleada para tratar infecciones fúngicas, dolor de cabeza, inflamación, dolor muscular, diarrea, fiebre, disentería, irritación de la piel y dolor de estómago. El objetivo del estudio fue desarrollar un protocolo utilizando micropropagación in vitro de P. sacharosa para aislar e identificar metabolitos bioactivos en las hojas de plantas aclimatadas y cultivadas en suelo de invernadero y exteriores. Empleando extracto etanólico y los compuestos purificados del mismo extracto, se realizó una evaluación de la actividad antinociceptiva y se exploró el mecanismo de acción en diferentes receptores inhibitorios, mediante la administración conjunta del extracto etanólico con naltrexona (antagonista opioide no selectivo), flumazenil (antagonista del receptor a benzodiacepinas / GABAA) o WAY100635 (5-HT1A / antagonista del receptor a serotonina). Adicionalmente se analizó la respuesta inmune en ratones CD1 o C57/BL6/JN expuestos a una dosis de lipopolisacárido (LPS) de E. coli, administrado en conjunto con el extracto etanólico de P. sacharosa, mediante la cuantificación de corticosterona e interleucina 6 (IL-6) en sangre tras 3 y 9 horas de exposición. Nuestros resultados mostraron que las tasas de micropropagación fueron de 7±0.64 brotes/segmento nodal usando 6-bencilaminopurina y 6±0.587 raíces/segmento nodal usando ácido indol-3-butírico, con una supervivencia del 100% tanto en invernadero como a la intemperie. El aislamiento de compuestos fenólicos del extracto etanólico se realizó mediante cromatografía en columna abierta en fase normal y reversa, empleando un gradiente de solventes polares y apolares. Posteriormente mediante el análisis fitoquímico en HPLC-MS, en conjunto con el hidrolisis acida, se demostró la presencia de canferol, y mediante la evaluación farmacológica de la actividad antinociceptiva del extracto etanólico en varias dosis (10-100 mg/kg, i.p.), se demostró un efecto significativo al disminuir el comportamiento de sacudidas y lamidas en ratones de la cepa CD1 en dosis de 30 y 100 mg/kg, i.p. del extracto. Las fracciones C1F6, C1F9 y C4F13 mostraron efectos significativos en ambas conductas a una dosis de 30 mg/kg, donde la fracción C4F13 inhibió completamente la nocicepción. La administración en conjunto del extracto etanólico con antagonistas de receptores a opioides, gabaérgicos o serotoninérgicos, no modificó el efecto antinociceptivo del extracto de hoja de P. sacharosa en la prueba de formalina, por lo que concluimos que el mecanismo de acción de esta planta es independiente de los mecanismos de acción de estas vías. La administración de LPS en conjunto con el extracto etanólico de P. sacharosa logró disminuir la concentración de corticosterona en sangre, pero no IL-6, tras 3 y 9 horas de exposición en ambas cepas, siendo la cepa CD1 la más receptiva. Se propone que la actividad antinociceptiva y el efecto analgésico de esta planta son generados en parte por los compuestos fenólicos, entre ellos el canferol, el cual podría inhibir la síntesis de citocinas inflamatorias, además dichos compuestos fenólicos son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica del cerebro. En conclusión, P. sacharosa no mostró participación en la modulación de la actividad de receptores nociceptivos a nivel central. Proponemos que el efecto analgésico de esta planta es generado por la presencia de compuestos fenólicos como el canferol y sus derivados, lo cual sustenta de manera científica las aplicaciones de esta especie en la medicina tradicional

Abstract Pereskia sacharosa Griseb is mainly distributed in the Bolivian Amazon, in traditional medicine; it was used to treat fungal infections, headache, inflammation, muscle pain, diarrhea, fever, dysentery, skin irritation, and stomachache. The aim of the study was to develop a protocol using in vitro micropropagation of P. sacharosa to isolate and to identify bioactive metabolites from leaves of samples from plants acclimatized and cultivated in greenhouse and outdoor soils. Using ethanolic extract and purified compounds, was performed the antinociceptive activity in the formalin test, and the mechanism of action was also explored in different inhibitory receptors by coadministration of the extract plus naltrexone (non-selective opioid antagonist), flumazenil (receptor antagonist of benzodiazepines/GABAA) or WAY100635 (5-HT1A/serotonin receptor antagonist) was carried out. In other hand, the LPS test was carried out in joint administration with ethanolic extract, the corticosterone and interleukin 6 in blood was quantified after 3 and 9 hours of exposure. Our results showed that the micropropagation rates were 7±0.64 shoots/nodal segment using 6-benzylaminopurine and 6±0.587 roots/nodal segment using indole-3-butyric acid, with 100% survival rate in greenhouse and outdoor. Isolation of phenolic compounds form ethanolic extract was performed by open column chromatography in normal and reverse phase, using gradient polar and no polar solvents. Subsequently, through the phytochemical HPLC-MS analysis performed with acid hydrolysis, showed kaempferol and derivatives presence. The pharmacological evaluation of the antinociceptive activity of the ethanol extract at several doses (10-100 mg/kg, i.p.) and the individual isolated fractions demonstrated significant activity by decreasing shaking and licking behavior in mice at doses of 30 and 100 mg/kg, i.p. of the extract. Meanwhile, fractions C1F6, C1F9 and C4F13 showed significant effects at a dosage of 30 mg/kg, where fraction C2F13 completely inhibited nociception. Co-administration of the isolated compound of P. sacharosa extract with opioid, GABAergic and serotonergic antagonist receptors did not modify the antinociceptive in formalin test; therefore, the mechanisms of action of this plant are not at the level of the central nervous system. While the LPS test together with the ethanolic extract reduced the concentration in blood of corticosterone, but not the IL-6; after 3 and 9 hours of exposure, in both strains. Being the CD1 strain the most sensitive, this test corroborated the antinociceptive activity and analgesic effect of phenolic compounds, specifically kaempferol, which was proposed as an inhibitor of the synthesis of inflammatory cytokines. Furthermore, these phenolic compounds can cross the blood-brain barrier. In conclusion, P. sacharosa did not show participation in the modulation of the nociceptive receptors at central level. We propose that the analgesic effect of this plant was generated by the presence of phenolic compounds such as kaempferol and its derivatives, which scientifically supports the applications of this species in traditional medicine.