RESUMEN
El virus sincitial respiratorio (RSV) es la etiología más importante de las infecciones respiratorias agudas, en particular bronquiolitis, en niños menores a 5 años. Los tratamientos actuales son costosos, algunos casos requieren hospitalización y no hay vacuna disponible. Una característica importante dentro de su fisiopatología es la generación de una respuesta inmune tipo 2 que favorece la agresividad de la infección. Una posible estrategia profiláctica, además de la estimulación con un antígeno, es el uso de co-estimuladores que permitan generar un balance hacia una respuesta inmune tipo 1, ya que se sabe es la que permite una mejor eliminación del RSV. Este trabajo tuvo como objetivo generar una proteína recombinante conformada por la proteína F del RSV, fusionada a un coestimulador para observar su efecto biológico en un modelo in vitro. Se transformaron bacterias Escherichia coli C43 con un vector de expresión procarionte con cuatro elementos: una secuencia que codifica para 6 histidinas para la purificación de la proteína, la secuencia del core de la estreptavidina, la secuencia del sitio II inmunogénico de la proteína F en un tándem de 3 y el coestimulador 4-1BBL de respuesta inmune tipo 1 (pET-6xHN-SA-F3X-4-1BBL). La producción de SA-F3X-BBL fue inducida con isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido 1 mM por 24h, purificada en columnas de níquel e identificada por western blot. Las células presentadores de antígeno RAW 264.7 se estimularon a diferentes concentraciones de proteína recombinante a las 24 y 48h, para analizar la activación del señalosoma 4-1BB/4-1BBL por western blot y qPCR. SA-F3X-BBL se purificó de la fracción soluble con un rendimiento de 5.6% con un peso moecular de 84.4 kDa. SA-F3X-BBL logró reclutar proteínas TRAF2 a partir de la estimulación con 4-1BBL, activando las vías de señalización p38 MAPK y NF-κB, produciendo rio abajo IFN-γ, TNF-α y BIRC5 principalmente por medio de p38 MAPK.
ABSTRACT
Respiratory syncytial virus (RSV) is the most important etiology of acute respiratory infections, mainly bronchiolitis, in children under 5 years old. RSV current treatments are expensive, and in some cases, hospitalization is required. Furthermore, there´s no vaccine available. An important characteristic within its pathophysiology is the generation of a type 2 immune response that favors the aggressiveness of the RSV infection. A possible prophylactic strategy, in addition to stimulation with an antigen, is the use of immune system costimulatory molecules that indices a skew towards a type 1 immune response, since it is known that it is the most adequate to viral clearance. In this work, we aimed to generate a recombinant protein with RSV F protein, fused with a costimulatory molecule, to observe its biological effect in vitro. C43 Escherichia coli cells were transformed with a prokaryote expression vector integrated by four elements: a histidine tail for protein purification, the sequence of core streptavidin, three repetitions of F protein immunogenic site II in tandem, and the immune response type-1 costimulatory molecule 4-1BBL (pET-6xHN-SA-F3X-4-1BBL). The production of SA-F3X-BBL was induced with 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactoside for 24h, purified with nickel columns and identified by western blot. Antigen presenting cells RAW 264.7 were stimulated with different recombinant protein concentrations at 24 and 48h, and western blot and qPCR were used to evaluate the activation of the 4-1BB / 4-1BBL signalosome. The recombinant protein was purified from the soluble fraction with a 5.6% yield and an 84.4 kDa molecular weight. SA-F3X-BBL succeeded in TRAF2 proteins recruitment from 4-1BBL stimulation, activation of p38 MAPK and NF-κB signaling pathways resulting in IFN-γ, TNF-α and BIRC5 downstream production, mainly through p38 MAPK.
