Efecto toxicológico y proteómica del veneno de la víbora de cascabel de la Isla Coronado Sur (Crotalus helleri caliginis), Baja California, México

Abstract

Versión español La península de Baja California tiene más de 250 islas e islotes, y cuenta con bastantes especies endémicas. Entre ellos, las serpientes de cascabel son los grupos más numerosos, pero también uno de los menos estudiados. El estudio de los venenos de las serpientes de cascabel de las islas podría guiarnos hacia una mejor comprensión de los procesos evolutivos y la descripción de nuevas toxinas. Se analizaron muestras de veneno de Crotalus helleri caliginis para determinar la posible variación ontogenética con electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) en una y dos dimensiones y con RP-HPLC. Además, se utilizaron Western Blot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y secuenciación amino-terminal para determinar los componentes principales del veneno. Las actividades biológicas y bioquímicas demuestran la similitud del veneno de C. helleri caliginis con la especie continental C. helleri helleri, ambas tienen baja actividad proteolítica y fosfolipasas A2 (PLA2) pero difieren en la ausencia de neurotoxina (similar a la crotoxina) en las especies insulares. Los principales componentes del veneno de C. helleri caliginis fueron las metaloproteasas, serina proteasas y crotamina, siendo el último el más abundante (30-35% del veneno completo). Los efectos sobre la hemostasia se reflejan en el aumento de los niveles de fibrinógeno en sangre debido a la inflamación generada por el veneno, un aumento de granulocitos, primeras células en un evento inflamatorio y una reducción de los niveles de linfocitos en respuesta al estrés fisiológico. Las plaquetas muestran una disminución en sus valores normales, siendo una posible causa la activación por liberación de calcio debido a la alteración de la membrana mitocondrial, efecto de la crotamina. La dosis letal 50 (DL50) del veneno de C. helleri caliginis en ratas, ratones y pollos fue de 0.54, 0.58 y 0.62 μg/g, respectivamente, siendo un veneno de crotoxina negativo. Aislamos la crotamina mediante cromatografía de exclusión molecular y documentamos el efecto en la preparación de hemidiafragma del nervio frénico de ratón, lo que provoca una reducción significativa de la fuerza de la contracción de la contracción muscular, además, el veneno crudo causa fasciculaciones en el músculo de ratón y rana. Los dos antivenenos mexicanos podrían neutralizar la letalidad del veneno de C. helleri caliginis, pero no los efectos de la crotamina.

English versión The Baja California Peninsula has over 250 islands and islets with many endemic species. Among them, rattlesnakes are the most numerous but also one of the least studied groups. The study of the venoms of island rattlesnakes could guide us to a better understanding of evolutionary processes and the description of novel toxins. Crotalus helleri caliginis venom samples were analyzed to determine possible ontogenetic variation with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in one and two dimensions and with RP-HPLC. Also, Western Blot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and Amino-terminal sequencing were used to determine the venom's main components. The biological and biochemical activities demonstrate the similitude of C. helleri caliginis venom with the continental species C. helleri helleri, both had low proteolytic and phospholipases A2 (PLA2) activity but differ in the absence of neurotoxin (crotoxin-like) on the insular species. The main component of the snake venom were metalloproteases, serine proteases, and crotamine, being the last one the most abundant (30-35% of full venom). The effects on hemostasis are reflected in the increase in fibrinogen levels in the blood due to the inflammation generated by the venom, an increase in granulocytes, first cells in an inflammatory evento and a reduction in lymphocyte levels in response to physiological stress. Platelets show a decrease in their normal values, being a possible cause the activation by calcium release due to the alteration of the mitochondrial membrane, an effect of crotamine. The lethal dose 50 (LD50) of the venom of C. helleri caliginis in rat, mice and chicken was 0.54, 0.58 and 0.62 μg/g, respectively, being a negative crotoxin venom. We isolated the crotamine using size-exclusion chromatography and documented the effect on mouse phrenic nerve-hemidiaphragm preparation, causing a significant force reduction of muscle twitch contraction, also, the crude venom cause fasciculations on mause and frog muscle. The two Mexican antivenoms could neutralize the lethality of C. helleri caliginis venom but not the crotamine effects.