Caracterización y evaluación de probióticos de microorganismos de montaña reproducidos artesanalmente en Aguascalientes

Abstract

RESUMEN Se llama microorganismos de montaña (MM) a la técnica de reproducción artesanal que aprovecha los microorganismos nativos del mantillo forestal para incorporarse a las unidades agropecuarias con varias funciones; una de estas como suplemento para el ganado por sus supuestos beneficios en parámetros productivos y gastrointestinales. La funcionalidad de los MM ha sido documentada principalmente en guías técnicas, pero se carece de evidencia científica para comprender sus dinámicas. Los probióticos son microorganismos vivos que cuando se suministran en cantidades apropiadas, confieren al huésped un beneficio para la salud. Los principales microorganismos identificados y aprovechados como probióticos son las bacterias ácido lácticas (BAL). Dentro de las BAL, el género Lactobacillus ha sido el foco de estudios y del mercado global. Otros microorganismos usados como probióticos son las levaduras Saccharomyces. En Aguascalientes el Área Natural Protegida Sierra Fría (ANP SF) contiene 90% de los bosques templados y de montaña del estado, cuenta con 13% de las 161 especies de Quercus de México y 84% de la diversidad de la entidad. Se encuentra con mayor frecuencia Q. potosina, y Q. sideroxyla en tercer lugar. Q. potosina se presenta en varias altitudes, es de menor porte, tiene hojas más grandes y de mayor senescencia que Q. sideroxyla, especie de mayor porte, hojas de menor tamaño, de poca senescencia y ubicada a mayor altitud en la ANP SF. La presente tesis tuvo como objetivo general caracterizar y evaluar el potencial probiótico de los microorganismos de montaña reproducidos artesanalmente a partir del mantillo forestal de Quercus spp. de la ANP SF. Para ello se plantearon cuatro objetivos específicos: (1) realizar la reproducción artesanal de MM a partir del mantillo forestal de Quercus spp. y la descripción de los productos; (2) aislar e identificar microorganismos de los productos MM mediante métodos tradicionales y moleculares; (3) evaluar el potencial probiótico de los microorganismos obtenidos de la reproducción artesanal de MM; y (4) desarrollar una guía con recomendaciones para la elaboración de los MM. El estudio se llevó a cabo entre agosto de 2019 y abril de 2021. Para el objetivo 1, se colectaron muestras de mantillo forestal, dos sitios de Q. potosina, dos de Q. sideroxyla y se incluyó una quinta muestra proveniente de una preparación artesanal elaborada en 2015 con mantillo de Q. potosina. Las muestras de cada sitio se procesaron en el Laboratorio de Recursos Fitogenéticos del Centro de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma de Aguascalientes (UAA). Se elaboraron productos fermentados en fase sólida (MMS) con 30 días de almacenamiento anaeróbico y a partir de estos se preparó otra fermentación anaeróbica en fase líquida (MMA) de una semana de procesamiento. Cada producto fue monitoreado y se describieron sus características observadas a simple vista. Se midió el pH de los MMS con distinto tiempo de almacenamiento entre los preparados y se realizaron lecturas semanales de pH de los MMA durante ocho semanas. El monitoreo del pH mostró que los productos mantienen estabilidad en su fase sólida y líquida y presentan semejanza con los procesos y características de los ensilajes y los alimentos líquidos fermentados para ganado. En el objetivo 2, se aislaron e identificaron los microorganismos de los cinco productos MMA mediante métodos tradicionales (cultivo en medios nutritivos, selectivos y diferenciales, tinciones y prueba de catalasa) y moleculares (análisis genérico por PCR) en el Laboratorio de Microbiología Sanitaria y Ambiental de la UAA. El análisis microbiológico de los cinco sitios mostró similitudes en las cantidades mesófilos aerobios, con siete unidades logarítmicas, también en las potenciales BAL, con ocho unidades logarítmicas, además se presentaron levaduras con cinco a siete unidades logarítmicas. En cuatro sitios no se detectaron potenciales enterobacterias y en ningún sitio se encontraron estafilococos. Se aislaron un total de 16 BAL y ocho levaduras de los cinco sitios, de estas 10 BAL y cinco levaduras fueron estudiadas. Mediante análisis por PCR, cinco aislados de BAL se identificaron como Lactobacillus y ninguna levadura resultó del género Saccharomyces. Para el objetivo 3, se aplicaron pruebas de resistencia a pH ácido (2 y 4) y 0.3% de sales biliares para evaluar el potencial probiótico de las BAL y levaduras aisladas de los 5 sitios durante el objetivo 2. Este análisis de potencial probiótico se realizó en el Laboratorio de Microbiología Sanitaria y Ambiental de la UAA. Las BAL y levaduras aisladas, mostraron en general un mejor comportamiento que los probióticos comerciales usados como control, con porcentajes de resistencia considerables y varias con diferencias significativas tras su cultivo a pH 2, 4 y 0.3% de sales biliares por 24 horas, indicando cierta potencialidad probiótica por su tolerancia in vitro a condiciones del tracto gastrointestinal. Para cumplir con el objetivo 4, se desarrolló una guía con recomendaciones para la elaboración de los MM a partir de la revisión bibliográfica, y los resultados y experiencias adquiridas durante la elaboración de esta tesis. La guía incluye observaciones y prácticas para productoras y productores que ya conozcan la técnica y busca aportar a la mejora de los materiales existentes, y a la preparación y uso responsable de los MM. Se concluye que, aunque se trate de un método artesanal, se pueden lograr productos MM con estabilidad y similitud en los valores de pH, así como en sus poblaciones microbianas y con presencia de BAL y levaduras con potencial probiótico. A pesar de sus diferencias en el origen del mantillo forestal, de la especie de Quercus y sus variables relacionadas (ubicación, altitud, época de colecta, características del mantillo). Además del tiempo de almacenamiento, insumos utilizados y método de preparación, ya que en el caso del producto del sitio 5, fue elaborado y manejado sin cuidados y contaba con cinco años de almacenamiento. Esta tesis representa un acercamiento preliminar para explicar los procesos que rodean a los preparados MM y su potencialidad probiótica, al abonar conocimiento científico de los MM. Sin embargo, es necesario realizar más evaluaciones tanto in vitro como in vivo, con el fin de comprender en detalle los procesos bioquímicos y las dinámicas microbianas que rodean a los MM, y así confirmar su capacidad probiótica, su seguridad y beneficios potenciales. Palabras clave: Bacterias ácido lácticas, Levaduras, Lactobacillus.

ABSTRACT Mountain microorganisms, MM henceforth, are called to the artisanal reproduction technique that uses communities of native microorganisms present in the forest litterfall, in order to be incorporated into farms with various functions, one of them as a supplement for livestock due to its potential benefits in productive and gastrointestinal parameters. The functionality of MM has been mainly documented in technical guides, but scientific evidence is lacking to understand its dynamics. Probiotics are live microorganisms that, when supplied in appropriate amounts, confer a health benefit on the host. The main microorganisms identified and used as probiotics are lactic acid bacteria (LAB, henceforth). Within LAB, the genus Lactobacillus has been the focus of studies and the global market. Other microorganisms used as probiotics are Saccharomyces yeasts. In Aguascalientes, the Sierra Fría Natural Conservation Area (SF NCA, henceforth) It contains 90% of the temperate and mountain forests of the state, has 13% of the 161 Quercus species in Mexico and 84% of the diversity of the state. Q. potosina is most frequently found, and Q. sideroxyla in third place. Q. potosina occurs at various altitudes, is smaller, has larger and more senescent leaves than Q. sideroxyla, a larger species, smaller leaves, of little senescence, and located at a higher altitude in the SF NCA The general objective of this thesis was to characterize and evaluate the probiotic potential of mountain microorganisms reproduced in an artisanal way from the forest litterfall of Quercus spp. of the SF PNA. For this, four specific objectives were proposed: (1) to carry out the artisanal reproduction of MM from the forest mulch of Quercus spp. and the description of the products; (2) isolate and identify microorganisms from MM products by traditional and molecular methods; (3) evaluate the probiotic potential of the microorganisms obtained from the artisanal reproduction of MM; and (4) develop a guide with recommendations for the preparation of MM. The study was carried out between August 2019 and April 2021. For objective 1, samples of forest litterfall were collected, two sites of Q. potosina, two of Q. sideroxyla and a fifth sample was included from an artisan preparation made in 2015 with litterfall of Q. potosina. The samples from each site were processed in the Laboratorio de Recursos Fitogenéticos at the Centro de Ciencias Agropecuarias of the Universidad Autónoma de Aguascalientes (UAA, henceforth). Solid-phase fermented products (MMS) were made with 30 days of anaerobic storage and from these, another liquid phase anaerobic fermentation (MMA) of one week of processing was prepared. Each product was monitored and its characteristics observed were described. The pH of the MMS was measured with different storage times between the preparations and weekly pH readings of the MMA were made for eight weeks. The pH monitoring showed that the products maintain stability in their solid and liquid phases and show similarities with the processes and characteristics of silage and fermented liquid feed for livestock. In objective 2, the microorganisms of the five MMA products were isolated and identified by traditional methods (culture in nutritive, selective and differential media, stains and catalase test) and molecular (generic analysis by PCR) in the Laboratorio de Microbiología Sanitaria y Ambiental of the UAA. The microbiological analysis of the five sites showed similarities in the aerobic mesophilic quantities, with seven logarithmic units, also in the potential LAB, with eight logarithmic units moreover, yeasts with five to seven logarithmic units were presented. Potential enterobacteria were not detected at four sites and Staphylococcus were found at no site. A total of 16 BAL and eight yeasts were isolated from the five sites, of these 10 LAB and five yeasts were studied. By PCR analysis, five LAB isolates were identified as Lactobacillus and no yeast resulted from the genus Saccharomyces. For objective 3, resistance tests were applied to acidic pH (2 and 4) and 0.3% of bile salts to evaluate the probiotic potential of the LAB and yeasts isolated from the 5 sites during objective 2. This probiotic potential analysis was carried out in the Laboratorio de Microbiológia Sanitaria y Ambiental of the UAA. The LAB and isolated yeasts, showed in general a better behavior than the commercial probiotics used as control, with considerable resistance percentages and several with significant differences after culturing at pH 2, 4 and 0.3% of bile salts for 24 hours, indicating certain Probiotic potential due to its in vitro tolerance to gastrointestinal tract conditions. To meet objective 4, a guide was developed with recommendations for the preparation of MM from the bibliographic review, and the results and experiences acquired during the preparation of this thesis. The guide includes observations and practices for producers who already know the technique and seek to contribute to the improvement of existing materials and the preparation and responsible use of MM. It is concluded that, although it is an artisan method, MM products can be achieved with stability and similarity in pH values, as well as in their microbial populations and with the presence of LAB and yeasts with probiotic potential. Despite the differences in the origin of the forest litterfall of the Quercus species and its related variables (location, altitude, collection time, characteristics of the litterfall), as well as storage time, inputs used, and preparation method, which in the case of the product from site 5, it was produced and handled carelessly and had five years of storage This thesis represents a preliminary approach to explain the processes that surround MM preparations and their probiotic potential, by contributing to the scientific knowledge of MM. However, further evaluations, both in vitro and in vivo, are required to fully understand the biochemical processes and microbial dynamics surrounding MM, and thus confirm their probiotic ability, safety, and potential benefits. Key words: Lactic acid bacteria, yeasts, Lactobacillus.