Evaluación de la actividad antiinflamatoria y citotóxica in vitro de Lepidium virginicum L. (Brassicaceae)

Abstract

RESUMEN Las plantas medicinales se utilizan en todo el mundo desde tiempos remotos para la prevención, atenuación o curación de enfermedades. En México, muchas especies de plantas se han utilizado desde tiempos prehispánicos para tratar diferentes afecciones. La planta Lepidium virginicum L. (Brassicaceae), conocida como lentejilla se ha usado para aliviar dolores de cabeza, procesos inflamatorios como enteritis aguda y crónica, diarrea y trastornos biliares. Sin embargo, a la fecha no hay estudios científicos que comprueben su efecto antiinflamatorio y citotóxico. Por tal motivo, el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del extracto metanólico de L. virginicum en la sobrevivencia de dos líneas celulares diferentes de cáncer de colon humano y sus efectos antiinflamatorios en una línea celular de macrófagos murinos. Los tallos de L. virginicum recolectados fueron desecados a temperatura ambiente, pulverizados y macerados secuencialmente con solventes en orden creciente de polaridad finalizando con metanol. Los extractos secos se pesaron y se diluyeron en agua bidestilada (J.T. Baker ®, México) para obtener soluciones concentradas de 10 y 1 mg/mL. A partir de las cuales se prepararon soluciones de trabajo de 0.001, 0.01 y 0.1 mg/mL del extracto en medio de cultivo celular y se filtraron usando filtros de jeringa CorningTM de 28 mm de diámetro, membrana PES de poro de 0.2 micras. Se hizo un análisis químico del extracto metanólico mediante cromatografía en capa fina y cromatografía en columna abierta. Para la actividad antiinflamatoria se analizó la expresión génica de tres citocinas, Factor de Necrosis Tumoral-α (TNF-α), Interleucina-1β (IL-1β) e Interleucina 6 (IL-6), en macrófagos RAW 264.7 mediante la técnica de RT-PCR. La actividad citotóxica del extracto se midió mediante ensayos colorimétricos de reducción de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) realizados por triplicado cada 24 o 48 h en las líneas celulares humanas de adenocarcinoma de colon HT-29 y Caco-2, y en fibroblastos humanos (Detroit 548), los cuales se utilizaron como un control de células no cancerosas. El análisis fitoquímico del extracto metanólico reveló la presencia de flavonoides, polifenoles similares al ácido clorogénico, terpenos y esteroles. La prueba de viabilidad celular por reducción del compuesto MTT, mostró que el extracto metanólico de L. virginicum exhibió un efecto citotóxico estadísticamente significativo sobre la línea celular Caco-2 a una dosis de 0.1 mg/mL, mientras que no tuvo efecto sobre las líneas celulares HT-29 y Detroit 548. Los resultados también demostraron que el extracto disminuye significativamente la expresión génica de la citocina proinflamatoria TNF-α en células RAW 264. Palabras clave: Plantas medicinales, cáncer, compuestos terapéuticos, metabolitos secundarios, cromatografía, RT-PCR, MTT.

ABSTRACT Since ancient times, medicinal plants have been used throughout the world to prevent, attenuate, or cure diseases. In Mexico, many species of plants have been used since prehispanic times to treat different conditions. The plant Lepidium virginicum L. (Brassicaceae), known as lentil, has been used to relieve headaches, inflammatory processes such as acute and chronic enteritis, diarrhea, and biliary disorders. However, to date, there are no scientific studies that prove its anti-inflammatory and cytotoxic effect. Therefore, the objective of this work was to evaluate the effect of the methanolic extract of L. virginicum on the survival of two different human colon cancer cell lines and its anti-inflammatory effects in a murine macrophage cell line (RAW 264.7). The collected stems of L. virginicum were dried at room temperature, pulverized, and macerated sequentially with solvents in increasing order of polarity, ending with methanol. The dry extracts were weighed and diluted in double distilled water (J.T. Baker ®, Mexico) to obtain concentrated solutions of 10 and 1 mg/mL. From which working solutions of 0.001, 0.01 and 0.1 mg / mL of the extract were prepared in cell culture medium and filtered using CorningTM syringe filters of 28 mm diameter, 0.2 μm pore PES membrane. A chemical analysis of the bioactive compounds present in the methanolic extract was carried out using thin-layer chromatography and open column chromatography. For anti-inflammatory activity, the gene expression of the TNF-α and IL-1β, and IL-6 in macrophages RAW 264.7 were analyzed employing the semi-quantitative RT-PCR technique. The cytotoxic activity of the extract was measured by 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazole bromide (MTT) reduction colorimetric assays performed in triplicate every 24 or 48 h in human colon adenocarcinoma cell lines HT-29 and Caco-2, and human fibroblasts (Detroit 548), which were used as a non-cancer cell control. Phytochemical analysis of the methanolic extract revealed flavonoids, polyphenols like chlorogenic acid, terpenes, and sterols. The cell viability test, performed by reducing the MTT compound, showed that the methanolic extract of L. virginicum exhibited a statistically significant cytotoxic effect on the Caco-2 cell line at a dose of 0.1 mg/mL, while it did not affect the HT-29 cell lines and Detroit 548. The results also demonstrated that the extract significantly decreased gene expression of the pro-inflammatory cytokine TNF-α in RAW 264 cells. Keywords: Medicinal plants, cancer, therapeutic compounds, secondary metabolites, chromatography, RT-PCR, MTT.