1. ABSTRACT
1.1 Spanish Version
Las infecciones del tracto urinario (ITU) afectan a más de 150 millones de personas, y representan un gasto mayor a 3,5 mil millones de dólares al año. Escherichia coli se asocia con el 70% -80% de ITU en su forma uropatógena (UPEC). Los factores de virulencia de UPEC como adhesinas, sideróforos y toxinas permiten la colonización del hospedero. Pero su papel en el desarrollo de ITU y efectos en el paciente no están totalmente entendidos. Uno de estos factores de virulencia es la toxina Autotransportadora vacuolizante (Vat), miembro de las Serin Proteasas Autotransportadoras de Enterobacteriaceae. Vat se ha identificado en 20% -36% de UPEC y se presenta en el 68% de los aislados de urosepsis, pero su mecanismo de acción sobre las células del huésped no es del todo conocido. Así, el objetivo del presente trabajo fue estudiar la correlación entre la presencia de factores de virulencia de E. coli, los síntomas clínicos, y el efecto de Vat en un modelo de urotelio de células de vejiga. El análisis demográfico de setenta y siete pacientes diagnosticados con ITU, reveló mayor incidencia de infección en las mujeres (77.93%) que en los hombres (22.07%), el análisis por PCR en punto final detectó factores de virulencia como fimH (76.6%), chuA (49.4%) y papC (42.9%). La presencia de genes de adhesión como fimH, papC y sfaS se relacionó con fiebre, cistitis, dolor suprapúbico y de espalda, en el huésped. La resistencia a los antibióticos en los aislados de E. coli mostró que Trimetoprim / Sulfametoxazol fue el fármaco que genera mayor resistencia (76.62%), seguido de Ampicilina (66.23%) y Ampicilina / Sulbactam (48.05%). El tratamiento del cultivo establecido de células de vejiga humana con Vat, en varias concentraciones a diferentes tiempos, provocó daño celular del 15% - 47% detectado a través del ensayo de liberación de la enzima LDH. Indujo la formación de vacuolas en el modelo de urotelio de forma dependiente del tiempo, además de la pérdida de contacto intercelular entre las células de vejiga, observada por microscopía electrónica de barrido, demostrada por el cambio en la distribución de moléculas de adhesión intercelular ZO-1 y ocludina detectado por inmunofluorescencia indirecta. El tratamiento con Vat produjo además cambios en la permeabilidad de la monocapa epitelial detectados a través del ensayo de permeabilidad celular en un sistema transwell. El daño celular produjo cambios en la distribución de F -actina, pérdida de las fibras de estrés en comparación con las células control. Vat también
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modificó la distribución de tubulina y Arp3. El marcador fluorescente para lisosomas Lysotracker mostró que las células tratadas con Vat presentaron vacuolas lisosomales y vacuolas sin contenido ácido. En modelo ex vivo con vejiga de ratón expuesta a Vat se mostró la pérdida de integridad del urotelio. En conclusión, Vat indujo daño celular, formación de vacuolas en las células de la vejiga y desprendimiento de la barrera urotelial.
1.2 English Version
Urinary tract infections (UTIs) affect more than 150 million people, costing more than $3.5 billion a year. Escherichia coli is associated with 70% -80% of UTI in its uropathogenic form (UPEC). UPEC has virulence factors such as adhesins, siderophores, and toxins that allows host colonization. But its role in the development of UTI and patient effects are not fully understood. One of these virulence factors is the Vacuolizing Autotransporter Toxin (Vat), a member of the Enterobacteriaceae Autotransporter Serin Proteases. Vat has been identified in 20% -36% of UPEC and occurs in 68% of urosepsis isolates, but its effect on host cells is not fully known. Thus, the objective of the present work was to study the correlation between the presence of E. coli virulence factors, clinical symptoms, and the effect of Vat in a bladder cell urothelium model. The demographic analysis of seventy-seven patients diagnosed with UTI revealed a higher incidence of infection in women (77.93%) than in men (22.07%), the end-point PCR analysis detected virulence factors such as fimH (76.6%), chuA (49.4%) and papC (42.9%). The presence of adhesion genes such as fimH, papC and sfaS was related to fever, cystitis, suprapubic and back pain in the host. Antibiotic resistance in E. coli isolates showed that Trimethoprim / Sulfamethoxazole was the drug that generates the highest resistance (76.62%), followed by Ampicillin (66.23%) and Ampicillin / Sulbactam (48.05%). Finally, the effect of Vat was assessed in an established culture of human bladder cells, at various toxin concentrations at different times, producing cell damage of 15% - 47% detected through the LDH enzyme release assay. Vat induced the formation of vacuoles in the urothelium model in a time-dependent manner, in addition to the loss of intercellular contact between the bladder cells, observed by scanning electron microscopy. Vat produced the change in the distribution of ZO-1 and occludin intercellular adhesion molecules detected by indirect immunofluorescence. The treatment with Vat also produced changes in the permeability of the epithelial monolayer detected through the cell permeability assay in a transwell system. Cellular damage produced changes in the distribution of F -actin, stress fibers loss compared to control cells and changes on tubulin and Arp3 distribution. To characterize the vacuoles nature of the vacuoles generated by Vat, the Lysotracker fluorescent marker for lysosomes was used. The Vat treatment showed lysosome vacuoles and vacuoles with non-acid content. In ex vivo model with mouse bladder exposed to Vat,
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loss of urothelial integrity was shown. In conclusion, Vat induced cellular damage and vacuoles formation in bladder cells, and the urothelial barrier.
