Efecto de enzimas comerciales sobre la liberación de compuestos fitoquímicos de subproductos agroindustriales y evaluación de sus propiedades funcionales

Abstract

Los subproductos agroindustriales debido a su composición son materiales ideales para realizar extracciones de compuestos bioactivos con enzimas degradadoras de polisacáridos. Las paredes celulares vegetales contienen polisacáridos tales como celulosa, hemicelulosa y pectinas que actúan como barreras para la liberación de sustancias intracelulares. Algunas enzimas como la celulasa, la β-glucosidasa, la xilanasa, la β-glucanasa y la pectinasa ayudan a degradar la estructura de la pared celular y despolimerizar los polisacáridos de la pared celular de la planta, facilitando la liberación de compuestos enlazados. Por lo tanto, estas enzimas han sido propuestas como herramientas para optimizar la extracción de compuestos a partir de la matriz vegetal. En este estudio se evaluaron actividades de endoglucanasa, exoglucanasa, β-glucosidasa, xilanasa y pectinasa para dos enzimas comerciales: Promote® y Fibrozyme® con la finalidad de aplicarlas en subproductos agroindustriales. Según los resultados, Promote® obtuvo valores de 2.69 ± 0.04 μkat/mL de muestra enzimática, 0.34 ± 0.02 μkat/mL de muestra enzimática y 0.76 ± 0.005 μkat/mL de muestra enzimática para las actividades de endoglucanasa, β-glucosidasa y pectinasa respectivamente, resultando ser mayores a las que obtuvo Fibrozyme®. Después se llevó a cabo la caracterización nutracéutica de las fracciones de extractos polifenólicos extraíbles (contenido de fenoles y flavonoides) y no extraíbles (taninos condensados e hidrolizables), así como la capacidad antioxidante utilizando DPPH como radical libre y la metodología FRAP de subproductos agroindustriales de guayaba (Psidium guajava), coliflor (Brassica oleracea var. Botrytis) y huitlacoche (Ustilago maydis). Se encontró que en la mayoría de los ensayos el subproducto de guayaba mostró niveles mayores de fenoles solubles, flavonoides, taninos hidrolizables y condensados (14.66 ± 0.36 mg GAE/g bs, 4.95 ± 0.23 mg eq. catequina/g bs, 26.84 ± 0.18 mg GAE/g bs y 230.19 ± 4.92 mg PA/g bs, respectivamente), al compararlas con los subproductos de coliflor y huitlacoche. Mismo comportamiento tuvieron dichos extractos al evaluar su capacidad antioxidante por medio del uso del radical DPPH y FRAP (30.47 ± 0.39 y 24.40 ± 0.43 mg eq. de Trolox/g bs, respectivamente). XIII Enseguida, se llevó a cabo la aplicación de las dos muestras enzimáticas fibrolíticas sobre el subproducto de guayaba. Se utilizó un tratamiento con Promote®, otro con Fibrozyme® y una combinación de ambas enzimas. Así mismo, se establecieron cuatro condiciones: pH 6, temperatura de 39 °C, concentración de enzima al 1.5 % p/p o p/v en BCF y cuatro tiempos de incubación (0.5, 1, 2 y 4 h) y se compararon con un control utilizando únicamente BCF pH 6, utilizándose como variables respuesta el contenido de fenoles y flavonoides. Se determinó estadísticamente que el tratamiento de 2 h utilizando Promote® fue el que mostró mejores resultados para flavonoides (5.67 ± 0.24 mg eq. catequina/g) y para fenoles (24.11 ± 0.38 mg eq. de ác. gálico/g). Con base en los resultados del anterior apartado, se optó por utilizar la mezcla enzimática Promote® en el subproducto de guayaba. Para ello se utilizó la MSR con un diseño central compuesto (DDC) para desarrollar un modelo de predicción para optimizar las condiciones de pretratamiento con esta enzima comercial, a fin de obtener los mayores de niveles de fitoquímicos posibles. Se evaluaron cuatro factores (concentración de enzima, pH, temperatura y tiempo de incubación) con cinco niveles codificados desde -α, -1, 0, 1 y α, utilizando como variables de respuesta contenido de compuestos fenólicos (Y1), contenido de flavonoides (Y2) y medición de la capacidad antioxidante utilizando DPPH como radical libre (Y3). Se obtuvo que las condiciones óptimas para maximizar las tres respuestas evaluadas fueron temperatura de 40 °C, tiempo de 3 h, concentración de enzima de 2.5 % (v/v) y pH 7; con valores predichos por el modelo de contenido de compuestos fenólicos de 6.74 ± 1.24 mg eq de ác. gálico/g), contenido de flavonoides de 2.97 ± 0.22 mg eq de catequina/g y para la medición de la capacidad antioxidante utilizando DPPH como radical libre un valor de 10.40 ± 1.55 mg eq de Trolox/g. La aplicación de la enzima comercial Promote® sobre el subproducto agroindustrial de guayaba liberó mayores niveles de compuestos fitoquímicos (fenólicos y flavonoides) con actividades funcionales (e.g. antioxidantes) importantes, en comparación con el control sin enzima.

The agro-industrial byproducts due to their composition are ideal materials for extractions of bioactive compounds with polysaccharide degrading enzymes. Plant cell wall polysaccharides such as cellulose, hemicellulose and pectins act as barriers for the release of intracellular substances. Some enzymes such as cellulase, β-glucosidase, xylanase, β-glucanase and pectinase help to degrade the cellular structure and depolymerize the polysaccharides of the plant cell walls, facilitating the release of the tightly bound compounds. Therefore, these enzymes have been proposed as tools to optimize the extraction of compounds from the plant matrix. In this study, activities of endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase, xylanase and pectinase were evaluated for two commercial enzymes: Promote® and Fibrozyme® with the purpose of applying them to agroindustrial by-products. According to the results, Promote® showed values of 2.69 ± 0.04 μkat / mL, 0.34 ± 0.02 μkat / mL and 0.76 ± 0.005 μkat / mL of enzymatic sample for the activities of endoglucanase, β-glucosidase and pectinase, respectively, resulting to be higher than those obtained for Fibrozyme®. The nutraceutical characterization of fractions of extractable polyphenolic extracts (content of phenols and flavonoids) and non-extractables (condensed and hydrolysable tannins), as well as the antioxidant capacity of DPPH as a free radical and the FRAP production of agroindustrial by-products from guava (Psidium guajava), cauliflower (Brassica oleracea var. Botrytis) and huitlacoche (Ustilago maydis), was carried out. It was found that in most of the evaluations, the guava by-product had higher levels of soluble phenols, flavonoids, hydrolysable and condensed tannins (14.66 ± 0.36 mg eq of gallic acid /g db, 4.95 ± 0.23 catechin mg eq./g db, 26.84 ± 0.18 mg eq of gallic acid /g db and 230.19 ± 4.92 mg PA/g db, respectively), when compared with the by-products of cauliflower and huitlacoche. A similar behavior was observed when those extracts were evaluated for their antioxidant capacity with the use of DPPH and FRAP radicals (30.47 ± 0.39 and 24.40 ± 0.43 mg Trolox eq./g db, respectively). XV In view of these results, the application of the two enzymatic fibrolytic products on the guava by-product was carried out. A treatment with Promote® alone, another with Fibrozyme® alone and a combination of both enzymes, were used. Likewise, four conditions were established: pH 6, temperature of 39 °C, enzyme concentration at 1.5% w/w or w/v in BCF and four incubation times (0.5, 1, 2 and 4 h) and these were compared with a control consisting of BCF pH 6; phenols and flavonoids contents were used as response variables. It was statistically determined that the 2-hour treatment using Promote® showed better results for flavonoids (5.67 ± 0.24 mg eq catechin/g) and for phenols (24.11 ± 0.38 mg eq of gallic acid/g). Based on the results of the previous section, the Promote® enzymatic mixture was used for its optimization in the guava by-product. For this, the RSM with a central composite design (CCD) was used to develop a prediction model to optimize the pretreatment conditions with this commercial enzyme, and in order to obtain the highest possible levels of phytochemicals. Four factors (enzyme concentration, pH, temperature and incubation time) were evaluated with five levels coded from -α, -1, 0, 1 and α, using as response variables: content of phenolic compounds (Y1), flavonoid content (Y2) and measurement of antioxidant capacity using DPPH as free radical (Y3). The optimal conditions to maximize the evaluated responses were temperature at 40 °C, reaction time during 3 h, enzyme concentration at 2.5% (v/v) and pH 7; with predicted values from the model of 6.74 ± 1.24 mg of gallic acid eq /g for phenolic compounds, 2.97 ± 0.22 mg of catechin eq/g for flavonoid content, and 10.40 ± 1.55 mg of Trolox eq/g for antioxidant capacity using DPPH as a free radical. The application of the commercial enzyme Promote® on the guava by-product released higher levels of phytochemical compounds (phenolics and flavonoids) with important functional (e.g. antioxidant) properties, in comparison with the control without enzyme.