Obtención de proteínas recombinantes como posibles vacunas a partir de la proteína LC3 de entamoeba histolytica

Abstract

Entamoeba histolytica (E. histolytica) es un protozoo parásito causante de la disentería y absceso hepático amibiano. Se estima que aproximadamente 50 millones de personas a nivel mundial se encuentran infectadas, la infección por este parásito deja entre 50,000 a 100,000 muertes por año. La lectina Gal-GalNac es una proteína ampliamente caracterizada, su función está asociada al reconocimiento, unión y muerte de las células del huésped. A partir del amplio conocimiento que se tiene de la función y estructura de la GalNAc, se planteó generar una proteína recombinante de fusión utilizando una porción rica en cisteína denominada LC3, esto con el objetivo de producir una vacuna contra este patógeno. Para esta finalidad se diseñó un gen sintético el cual codifica para el fragmento LC3 de E. histolytica fusionado a la secuencia del gen de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (PE), con deleción en el dominio III (PEIII) y a su vez a la secuencia KDEL3 con optimización de codones para la expresión en Pichia pastoris (P. pastoris). El transgen PEIII-LC3-KDEL3 fue subclonado en el plásmido pPIC9 para la expresión inducible con metanol. Utilizando la técnica de PCR y el análisis de restricción enzimática identificamos y seleccionamos clonas transformadas positivamente con el plásmido pPIC9-PEIII-LC3- KDEL3. La integración del vector en el genoma de la levadura se analizó por PCR. Una vez caracterizada la integración del cassette de expresión en el genoma de la levadura, se realizaron ensayos de expresión y producción de la proteína y mediante SDS-PAGE y Western-blot se pudo identificar una proteína glicosilada de aproximadamente 67 kDa en fracciones purificadas. El anticuerpo anti-6X His tag mostró una alta especificidad de reacción la cual fue consistente con la reactividad mostrada por el anticuerpo anti-E. histolytica permitiéndonos confirmar la presencia de la proteína PEIII-LC3-KDEL3. El escalamiento de la proteína se realizó en un biorreactor de tanque agitado en condiciones controladas, donde el producto (3.8 g/L) obtenido fue purificado y evaluado. Para probar la capacidad de PEDIII-LC3-KDEL3 de inducir una respuesta inmune, se llevó a cabo inmunización en hámsteres (Mesocricetus auratus) utilizando diferentes dosis del antígeno recombinante, y a través de ELISA se hizo la detección de IgG total. Los resultados obtenidos muestran niveles significativos de IgG lo cual nos sugiere que el antígeno PEDIIILC3- KDEL3 tiene aplicaciones potenciales como un inmunógeno para la vacunación contra E. histolytica.

Entamoeba histolytica (E. histolytica) is a protozoan parasite of disentery and amebic liver abscess. It is estimated that approximately 50 million people worldwide are infected, of which occur between 50,000 and 100,000 deaths per year. Gal-GalNac lectin is a widely characterized protein, it associated with recognition, binding and death of host cells. From the extensive knowledge of the function and structure of Gal-GalNac, it was proposed to generate a recombinant fusion protein using a cysteine rich portion LC3. The aim of generate this recombinant protein is to be used as a vaccine against this pathogen. For this purpose, a synthetic gene was designed which encodes the E. histolytica LC3 fragment fused to the Pseudomonas aeruginosa (PE) exotoxin A gene sequence deletion in domain III (PEΔIII), also the KDEL3 sequence was included, the whole synthetic gene was codon optimization for expression in Pichia pastoris (P. pastoris). The PEΔIII-LC3-KDEL3 transgene, was subcloned into the plasmid pPIC9 for it expression inducible with methanol. By PCR and the enzymatic restriction analysis, integration of the vector into the yeast genome was analyzed. Once the transformed clones were characterized to test the vector integration, protein expression and purification assays were performed. With SDS-PAGE and Western blot analyzes a glycosylated protein of approximately 67 kDa could be identified in purified fractions. The anti-6X His antibody showed a high specificity of reaction, which was consistent with the reactivity shown by the antibody anti-E. histolytica, it allowed to confirm the presence of the protein PEΔIII-LC3-KDEL3. The production was performed in a stirred tank bioreactor under controlled conditions, where the product obtained was purified and evaluated. To test the immunogenic capacity of PEDIII-LC3-KDEL3, an immunization protocol was stablished in hamsters (Mesocricetus auratus) at different doses of the recombinant antigen, the detection of total IgG was performed by ELISA. The obtained results show significant increased IgG levels, this result suggest that the PEDIII-LC3-KDEL3 antigen has potential applications as an immunogen for vaccination against E. histolytica.