Estudio del efecto antiinflamatorio del análogo sintético de la GnRH, acetato de leuprolida, en rata

Abstract

RESUMEN La inflamación, es una respuesta de tejidos vascularizados frente a una agresión local o sistémica. Ésta, a su vez, se divide en inflamación aguda y crónica: la primera se caracteriza por la presencia de cambios vasculares, la infiltración de leucocitos (principalmente neutrófilos polimorfonucleares) y la participación de mediadores inflamatorios. Con el tiempo, la inflamación aguda desaparece a partir de la remoción del estímulo agresor, la reparación del tejido dañado y se presenta la restauración de la homeostasis. Cuando la inflamación aguda no se resuelve y se prolonga por bastante tiempo, ésta progresa a inflamación crónica. Este tipo de inflamación, se caracteriza por presencia de angiogénesis, infiltrado de células mononucleares (principalmente macrófagos), fibrosis y una pérdida progresiva de la estructura y funcionalidad del órgano o tejido. Debido a que los medicamentos actuales producen efectos adversos importantes, se decidió probar el efecto antiinflamatorio (de tipo agudo y crónico) del análogo sintético de la GnRH, acetato de leuprolida (AL), en ratas Wistar macho. Este análogo de la GnRH, es considerado como un compuesto muy seguro y tolerable y estudios recientes han reportado que presenta una actividad inmunomoduladora (Guzmán et al., 2015). Así mismo, también se analizó su toxicidad sobre células de la respuesta inflamatoria, a concentraciones crecientes que iban de 0.1 a 500 nM. Las pruebas de toxicidad con AL, se llevaron a cabo en mastocitos, los cuales se sometieron a una concentración de 0.1, 38, 50, 80 y 500 nM, durante 24 h de incubación, a una presión y temperatura constantes, dentro de una cámara húmeda de CO2. La viabilidad celular se obtuvo por medio de una prueba de MTT (sales de tetrazolio), las cuales son metabolizadas por enzimas deshidrogenasas o con capacidad óxido reductasa, en células vivas o metabólicamente activas. De acuerdo al porcentaje de viabilidad celular obtenido a partir de la lectura arrojada por el espectrofotómetro, el AL no presentó actividad citotóxica a ninguna concentración. Por el contrario, se obtuvo un incremento de la viabilidad celular, a la dosis más alta (500 nM). El efecto antiinflamatorio del AL, se analizó por medio de un modelo de inflamación aguda y crónica. Las dosis de AL se tomaron en base al protocolo de Díaz- Galindo y colaboradores (2015). En ambos modelos se utilizaron 3 grupos: Controles (C), a los cuales se les administró 100 μl de solución salina fisiológica al 0.9% (S.S.F) vía intramuscular (IM); Indometacina (I), tratados con 5 mg de indometacina, por Kg de peso corporal del animal, disuelta en S. S. F y administrada por vía oral (VO) y Tratados (T), los cuales recibieron como tratamiento, 10μg de AL por Kg de peso corporal del animal, disuelto en S. S. F, vía IM. En el modelo agudo de inducción de edema plantar por inyección de carragenina (CA) al 1%, se administró S.S.F o AL, como tratamientos profilácticos de 12 y de 3 días, antes de la inducción del edema plantar y cada tercer día. En otro ensayo se administró S. S. F, AL e I, 30 minutos previos a la inducción del edema plantar. Para la inducción de este último, se inyectaron 100 μl de CA al 1 % , en la zona plantar de la pata derecha de cada una de las ratas y 100 μl de S. S. F en la zona plantar de la pata izquierda. El volumen de cada una de las patas se midió con ayuda de un vernier digital, a las 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 24 h de haber inyectado la CA. Únicamente se observó un efecto inhibitorio de la formación del edema por parte del AL administrado como tratamiento profiláctico de 3 días, el cual fue significativo respecto al control, a las 2 h de haber inducido el edema. A partir de ahí, ya no se apreció efecto alguno. En el modelo crónico de inducción de granuloma por pastilla de algodón, se administró S.S.F o AL, como tratamientos profilácticos de 12 y de 3 días antes de la inducción del granuloma y cada tercer día, hasta el día 8 de la extracción del mismo. En otro ensayo se administró S.S.F, AL e I, un día después de la inducción del granuloma y cada tercer día (a excepción de la I que se administró diariamente) hasta el día 8 de la extracción del granuloma. Para el desarrollo de este modelo, se le colocaron a nivel subcutáneo, 4 pastillas de algodón estériles de 10 mg en las zonas axilares e inguinales de cada una de las ratas. Al día 8 las ratas fueron sacrificadas y se removieron quirúrgicamente los granulomas ya formados. Los granulomas se dejaron secar en una estufa a 57°C hasta obtener un peso seco constante (al tercer día) y a partir de éste, se calculó el porcentaje de inhibición de la formación del granuloma. Cabe señalar que en este modelo, no se observó un efecto de inhibición de la formación del granuloma que fuera estadísticamente significativo respecto al control, por parte del AL, ya sea como tratamiento profiláctico o terapéutico.

ABSTRACT Inflammation is a response of vascularized tissues by a local or systemic aggression. This, at the same time, is divided into acute and chronic inflammation: the first is characterized by the presence of vascular changes, the infiltration of leukocytes (mainly polymorphonuclear neutrophils) and the involvement of inflammatory mediators. With the time, acute inflammation disappears from the removal of the aggressor stimulus, the repair of damaged tissue and the restoration of homeostasis. When acute inflammation does not resolve and lasts for a long time, it progresses to chronic inflammation. This type of inflammation is characterized by the presence of angiogenesis, mononuclear cell infiltration (mainly macrophages), fibrosis, and a progressive loss of structure and function of the organ or tissue. Due to medications produce significant adverse effects, it was decided to test the anti-inflammatory (acute and chronic) effect of the synthetic analogue of GnRH, leuprolide acetate (AL), in male Wistar rats. This GnRH analogue is considered to be a very safe and tolerable compound and recent studies have reported that it has an immunomodulatory activity (Guzmán et al., 2015). Also, their toxicity was analyzed on cells of the inflammatory response, at increasing concentrations ranging from 0.1 to 500 nM. AL toxicity tests were performed on mast cells, which were subjected to a concentration of 0.1, 38, 50, 80 and 500 nM for 24 h of incubation at constant pressure and temperature within a chamber Wet CO2. Cell viability was obtained by MTT (tetrazolium salts), which are metabolized by dehydrogenase enzymes or with a oxidase reductase capacity in living or metabolically active cells. According to the percentage of cell viability obtained from the reading thrown by the spectrophotometer, the LA showed no cytotoxic activity at any concentration. In contrast, an increase in cell viability was obtained at the highest dose (500 nM). The anti-inflammatory effect of LA was analyzed through a model of acute and chronic inflammation. The doses of LA were taken based on the protocol of Díaz-Galindo et al. (2015). In both models, 3 groups were used: Controls (C), which were administered 100 μl of 0.9% physiological saline solution (S.S.F) intramuscularly (IM); Indomethacin (I), treated with 5 mg of indomethacin per kg body weight of the animal, dissolved in S.S.F. and administered orally (VO) and treated (T), which received as treatment 10 μg AL per kg Body weight of the animal, dissolved in S.S F, via IM. In the acute model of plantar edema induction by injection of 1% carrageenan (CA), S.S.F or AL were given as prophylactic treatments of 12 or 3 days, prior to induction of plantar edema and every third day. In another trial, S.S.F, AL and I were administered 30 minutes prior to induction of plantar edema. For the induction of the latter, 100 μl of 1% CA were injected into the plantar area of the right foot of each of the rats and 100 μl of S.S.F in the plantar area of the left paw. The volume of each of the legs was measured using a digital vernier at 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 24 h after have injected CA. Only an inhibitory effect of the edema formation on the part of the AL administered as a 3-day prophylactic treatment was observed, which was significant regarding the control, at 2 h after inducing the edema. From then on, no effect was seen. In the chronic model of granuloma induction by cotton pellet, S.S.F or AL were given as prophylactic treatments 12 or 3 days before granuloma induction and every third day until day 8 of the granuloma induction. In another trial, S.S.F, AL and I were given one day after induction of the granuloma and every third day (except for I, which was administered daily) until day 8 of granuloma withdrawal. For the development of this model, 4 sterile of 10 mg cotton pellets were placed at the subcutaneous level in the axillary and groin areas of each of the rats. At day 8, the rats were sacrificed and the granulomas already formed were removed surgically. The granulomas were allowed to dry in an oven at 57 ° C until a constant dry weight (on the third day) was obtained and from this, the percentage of inhibition of granuloma formation was calculated. It should be noted, that in this model, there was no inhibitory effect of granuloma formation that was statistically significant with respect to AL control either as a prophylactic or therapeutic treatment.