Production of a poultry vaccine for Newcastle disease using transient expression in tobacco

Abstract

RESUMEN La enfermedad de Newcastle (ND) es causada por el virus NDV o paramyxovirus aviar serotipo-1 (AMPV-1) y es considerada como la mas importante enfermedad en la industria avícola alrededor del mundo (Alexander 2003). En México, es una enfermedad con gran significancia económica y de salud para la industria mexicana avícola, desde principios de los 50’s. El NDV pertenece a la familia Paramyxoviridae y como la mayoría de los miembros de esta familia el virion de ND contiene dos tipos de glicoproteínas de superficie, la proteina de fusión (F) y la proteina hemaglutinina-neuraminidasa (HN), las cuales son los mayores determinantes antigénicos y los epítopos que estimulan la producción de anticuerpos neutralizantes de virus ya han sido determinados para ambas proteínas F (Toyoda et al 1988) y HN (Chambers et al 1988; Iorio et al 1991). La practica de la vacucnacion para la prevención de enfermedades animales ha sido usada por cientos de años y ha probado ser un arma poderosa para disminuir el sufrimiento animal, asi como también el bien económico de productores de productos animales. A pesar de que la tecnología de las vacunas ha hecho progresos sustanciales, el concepto básico sigue siendo el mismo. La mayoría de las vacunas actuales están compuestas de cepas de NDV, ya sea inactivadas o lentogénicas (poco virulentas) vivas. Sin embargo, las vacunas vivas son infecciosas y las inactivadas pueden inducir miedo de una posible aparición de la enfermedad (Gallili and Ben-Nathan 1998; OIE 2010). Este problema puede ser resuelto con el uso de vacunas de subunidad, las cuales están compuestas solo con la proteina antigénica o el epitopo del virus o bacteria. Recientemente, las plantas han sido investigadas como una fuente para la producción de agentes terapéuticos tales como vacunas, anticuerpos y biofarmacéuticos. Estos sistemas de expresión con plantas proveen muchas ventajas tales como la falta de riesgo de contaminación con patógenos animales, ambientes con calor estable y puede evitar peligros relacionados a la inyección si son admisnistrados como agentes comestible (Thanavala et al 2006). Adicionalmente, ha habido una tendencia creciente hacia el uso de sistemas de expresión transitoria en años recientes, principalmente para vacunas producidas en plantas. La mayor razón de esto es meramente por conveniencia y velocidad. En este estudio, nosotros intentamos expresar transitoriamente la proteina HN en hojas cosechadas de Nicotiana benthamiana, usando agroinfiltración con vacio para la entrega del gen exógeno. El ADNc de una cepa del NDV aislada del ultimo brote en California, US (CA02) fue modificada y los codones se optimizaron para obtener cuatro diferentes construcciones (HNop1, 2, 3 y 4), las cuales fueron sintetizadas de novo y clonadas en tres diferentes sistemas de expresión (TRBO, CMVva y 35S). La cinetica de expresión fue medida los días 2, 4 y 6 post infiltración (DPI) mediante ELISA. Después del escrutinio de los sistemas de expresión, las construcciones HNop y los DPIs diferencias significativas (P<0.05) fueron encontradas. Donde, el rendimiento mas alto fue obenido en el DPI 6 usando el sistema de expresión TRBO con la construcción HNop1 (~20mg/kg PF). El peso molecular esperado de la proteina HN expresada en planta (~60 kDa) fue confirmado a través de un ensayo de Western blot en todas las muestras. Lo mas importante, en este estudio demostramos que usando la plataforma de biofabricacion SwiftVax® en seis días podemos producir hasta 1000-1300 dosis de 15-20μg. Por lo tanto, futuros brotes pueden ser sobre llevados produciendo vacunas de subunidad en días en lugar de meses.